链霉菌实验操作6

（1）将干净的胶板装好，用琼脂糖胶（至少1％浓度）封边。

（2）配分离胶，配方如下：（1.5mm厚的胶需要10ml）

10%分离胶（5ml）：去离子水1.25ml，30%丙烯酰胺1.7ml，1M This-HCl（pH=8.8）1.95ml，10% SDS 50ul，10%过硫酸胺100ul，TEMED 2ul。（倒胶前才加入TEMED催化剂）

（3）用去离子水密封液面，左右轻轻摇摆使液面水平（聚丙烯酰胺的聚合不能接触氧气，所以用水封液面，水还能使聚丙烯酰胺的上液面保持平整。）

（4）室温聚合或放温箱中加速聚合，倾斜胶板吸出水，倒浓缩胶（1.5mm厚的胶需要3ml）。浓缩胶配方如下：

浓缩胶1ml：去离子水0.68ml，1M This-HCl（pH=6.8）0.13ml，30%丙烯酰胺0.17ml，10% SDS 10ul，10%过硫酸胺10ul，TEMED 1ul。（倒胶前才加入TEMED催化剂）

（5）插上梳子，等胶凝固后，拔掉梳子，如果胶孔里有很多气泡，需要用滤纸剪成小条吸去气泡。

（6）加入电泳缓冲液点样电泳，蛋白在浓缩胶时可以用150V电压，在分离胶时可以用250V电压，注意观察蛋白的浓缩效果，如果浓缩效果不好说明电泳缓冲液或配胶时的缓冲液用的次数过多，或已经不能用了，电泳缓冲液可用4-5次。

（7）电泳完毕后用染色液染胶至少1小时，脱色2至5小时（根据胶的厚度），其间换脱色液2-3次，可用水继续脱色和短期保存胶，或制备干胶长期保存。

 

试剂：

30%丙烯酰胺：29g丙烯酰胺，1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺，温去离子水定容到100ml（请先在棕色瓶子上做好记号定容，丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺都有毒，要带手套和口罩操作，不要污染量桶）

Tris-Gly电泳缓冲液（5倍，1L）：15.1g Tris，94g Glycine，pH8.3，50ml 10%SDS，去离子水定容。

10%过硫酸胺：0.5g过硫酸胺，去离子水定容到5ml。4度保存。（此物容易失活，最好每次少量配置。胶凝不了，凝的时间长或凝得不充分多半是它的问题。过硫酸胺在聚合反应过程中提供自由基。）

脱色液（0.5L）：50ml冰醋酸，225ml甲醇，225ml去离子水。（甲醇有毒）

（或50ml冰醋酸，235ml 95%乙醇，215ml去离子水。）（防止挥发，密闭保存。）

染色液：0.25%（染色效果不好就加大）的考马斯亮蓝溶于脱色液中。

 

可溶性蛋白的表达没有固定的方法，对不同的蛋白会有不同的方法，如果抽出的可溶性蛋白不多，可用基本培养基代替LB，用30或25度培养代替37度，IPTG（诱导物）的量也可减少，诱导时间也可变化。下面的方法仅供参考:

1．  将菌接种于5ml LB（含抗生素）培养基中过夜培养，

2．  将过夜培养物全部接种到200ml含抗生素的 MM培养基中，37度培养4-5小时，加IPTG至终浓度0.5mM（可变），37度培养13小时。

3．  将细胞培养物用20mM的冰冷的Tris-HCl（pH=7.5）浓缩10倍，

4．  在冰上用超声波处理（power lever为4-5，duty设为40－50％，60-120次脉冲，每30次脉冲后在冰中放30秒冷却），

5．  4度10000rpm离心10分钟,

6．  将上清通过0.45um的滤膜（细菌过滤器）

 

附：MM培养基（1L）

硫酸铵1g，磷酸氢二钾0.5g，7水硫酸镁0.2g，7水硫酸亚铁0.1g

 

方法一：原生质体法

用作链霉菌原生质体的一般步骤作到用过滤器过滤那一步，后面的操作就和大肠杆菌一样。

方法二：液氮法

1．  将摇好或从平板（铺有玻璃纸）上刮下来的菌体放入已经由液氮预冷了的拈砵中，加液

氮，用瓷棒将菌体磨成粉状，其间可加一两次液氮。（摇的菌体需先离心去掉培养基）

2．  将粉末收集到冰冻过的瓶子中（可-70度保存）

3．  直接加pH为7.4（或其他）的20mM Tris-HCl到一定体积

用大肠杆菌的方法加上样液，煮菌体，上样。（加上样液之前后一定将菌体尽量打散，可防止菌体不能完全破裂，且加入1M的DTT至终浓度50mM防止加热时二硫键的形成。）

 

诱导蛋白表达：

1．  取过夜培养物50ul-200ul接种于5ml含抗生素的Universal瓶中

2．  37度摇2小时左右

3．  取一定体积的菌液做阴性对照，其余的加IPTG至终浓度为0.2mM（可变）（4ml培养基加80mM的IPTG10ul）

4．  37度摇2小时左右

检测蛋白表达：

5．  取100ul（或更多）培养物，用pH值为7.4的20mM Tris-HCl（或PBS 7.4）浓缩10倍或5倍。（菌体多时也可不浓缩）

6．  加等体积的2倍上样液（Sampling Buffer），或1／9体积10倍上样液。（加上样液之前后最好将菌体尽量打散，可防止菌体不能完全破裂，还可加入1M的DTT至终浓度50mM防止加热时二硫键的形成。）

7．  100度煮2-4分钟

8．  12000rpm，离心1min（菌体破碎完全时也可不做）

9．  取上清点样做SDS-PAGE

 

部分试剂：

1．  蛋白上样buffer(2倍)（10ml）：

SDS 0.2g，溴酚蓝0.0006g，1M Tris-HCl (pH=6.8) 0.8ml，glycerol 1.5ml。

2．  蛋白上样buffer(10倍)（10ml）：

SDS 1g，1MTris-HCl (pH=6.8)2.5ml，溴酚蓝0.003g，glycerol 4ml。

3．1M DTT（二硫苏糖醇）

3.09g DTT溶于20ml 0.01mol／l 乙酸钠，过滤除菌，分装，-20度储存。

 

1.         SDS-PAGE

2.         将胶切成所需的大小放入转移缓冲液中15-60分钟。（胶在不同的缓冲液中会有不同的大小，这一步能让胶的大小达到平衡。0.7mm的胶只需平衡20分钟左右，1.5mm的胶需平衡40分钟）

3.         将电转夹板平放在桌面上（先垫一层保鲜膜），依次在夹板的一面放上海绵，滤纸，胶（塑料片），膜，滤纸，海绵，关闭夹板。（所有的东西都要先用转移缓冲液（transfer buffer）浸湿；胶和膜之间不能留有气泡；需要用洁净的玻璃棒从一侧开始把气泡赶走；塑料片放在胶的旁边；蛋白转移一般用硝酸纤维素膜，光的一面朝向胶；滤纸的大小和海绵差不多，膜的大小比胶稍微大一点）

4.         将电转夹板放入电转槽中，有胶的一面朝向负极，电转槽中可放入搅拌子，在电转时搅拌可是缓冲液离子和温度保持均一，电转应在4度（冰箱中）进行，可30V过夜电转或70V电转5小时。

5.         拆开电转夹板，将膜放入洁净的培养皿（7cm）中，用丽春红（Ponceau S）染液染色5分钟，室温，缓慢摇动。用去离子水脱色数秒钟，倾出去离子水，可以看见蛋白质红色的条带。（此步可不做，染色并不是很清楚。）

6.         用TBS润洗膜10分钟，脱去丽春红为止，如果没做第五步，则只需稍微润洗两三次即可，去掉SDS和电转缓冲液。

7.         倒掉所有的TBS，用封闭液（blocking solution）浸泡膜一小时，室温（或4度，过夜），轻轻摇动

8.         用TTBS将膜润洗两三次（不需停留）

9.         将膜泡入含一抗的封闭液中，室温，轻摇2小时

10.     将一抗收集可在4度保存至少1-2周仍然有活性，（含有终浓度为0.02％的叠氮化钠防腐）

11.     重复8

12.     用含二抗的封闭液孵育1小时，收集含二抗的封闭液同步骤10

13.     重复8

14.     加显色液NBT-BCIP（10ml），暗处显色，摇动，5分钟至数小时内可显色好。

 

ponceau S Stain（丽春红染液）：

1ml冰醋酸，0.5g Ponceau S，去离子水100ml

TBS：

150mM NaCl，25mM This-HCl （pH＝7.4）

TTBS：

0.5％ Tween-20 in TBS

封闭液（blocking buffer）（约2％）：

2.5g脱脂奶粉 用TBS定容到100ml，电炉上加热（用大些的容器防止产生大量气泡），冷却，用玻棒刮去表面的油脂，再加热冷却数次，滤纸过滤，用去离子水定容到100ml。长期保存需加叠氮化钠至终浓度0.02％。

Transfer Buffer（电转缓冲液）：

300ml甲醇，3.64g Tris Base，21.6g Glycine，去离子水定容到1.5L

 

电转的容器需最后用去离子水漂洗。所有的操作都要戴手套，防止手上的油脂和蛋白污染膜，也避免SDS，甲醇等试剂沾到手上。用一个洗净了的培养皿和保鲜膜做杂交和洗膜、显色等操作。

硝酸纤维素膜使用浙江台州的，0.45nm孔径，130nm厚度

使用北京六一电泳仪器厂生产的电转槽（40B）。

二抗用AP偶联的羊抗小鼠或羊抗兔抗体，使用NBT／BCIP染色试剂盒进行显色（华美，NBS82112天源代理）

抗体的稀释比例请参照产品说明和经验。