病毒滴度测定

  有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。

1． VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）

2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）

3． PFU（空斑形成单位） 

4． TCID50（50%组织培养感染剂量） 

不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。

1． 测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。

2． GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。

3． PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。

4． TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。

所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。

对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差100倍以上，典型的数据见表6。所有结果都只是大概的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒/2个颗粒。下一部分，我们将详细描述3种不同的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和耗时。无论选择那种方法，稀释和滴定过程必须重复操作以得到精确结果。一般来说，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度应为：

      106~107         第一代细胞经冻融后

      108~109         100倍数量的细胞经过冻融后

      1010~1011       用氯化铯方法纯化后

表6：各滴度测定方法特性

方法 类型 时间 可重复性 滴度* 评注 

VP 物理学方法 2小时 好 5×1012

GTU 生物学方法 2天 可变 2×1011

PFU 生物学方法 21天 变化很大 5×1010 传统方法

TCID50 生物学方法 10天 可变 2.5×1011 昆腾公司标准方法

以VP法测得的5×1012的病毒保存液为标准

5.8.1 O.D.260 nm（VP/ml）

这种方法只是通过DNA量来表示病毒滴度。相关系数为1.1×1012/ OD260 单位。由于大多数分光光度计在OD值小于0.1时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释10倍，因此如果 OD值大于0.1，我们可以估计病毒量大于1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含缺陷性颗粒。

1． 4℃融化病毒保存液。

2． 在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（0.1%SDS，10mMTris PH7.4，1mMEDTH）准备二个病毒稀释度。

最小需要量为： s 

病毒裂解液   病毒       稀释度

52ul       52ul       1：2（稀释液1）

168ul      42ul       1：5（稀释液2）

注意：病毒滴度高时（1013/ml）用1：10和1：20稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD值在0.1~1.0之间。

3． 56℃震荡培养10分钟。  0 uf'gbjf 

4． 准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替病毒裂解液。

5． 测定260nm处吸光值：

稀释液1再稀释1：5，为稀释液3。

稀释液2再稀释1：5和1：10，分别为稀释液4和稀释液5。

测定稀释液5（2次）、4、3的OD260，取此4值的平均值作为最终结果。 

例如

1． 将450ulVLB和50ul稀释液即透析缓冲液加入比色杯中。

2． 记下空白管读数后弃去，不要冲洗。

3． 加入450ulVLB和50ul 1：5稀释样本（稀释液2），组成稀释液5。

4． 记下读数后弃去。

5． 清洗比色杯，加入样本重复测一次。

6． 清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：5稀释空白液。 

7． 记下空白管读数后弃去，不要清洗。

8． 加入400ul VLB和100ul 1：5稀释样本，组成稀释液4。

9． 记下读数后弃去。

10． 清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：2稀释空白液。

11． 记下空白读数后弃去，不要清洗。

12． 加入400ul VLB和100ul 1：2稀释样本，组成稀释液3。

13． 记下读数后弃去。

将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度：

OD260×病毒稀释度×测定稀释度×1.1×1012= OPU/ml

5.8.2 空斑测定法

空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。

1． 5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿

。

2． 在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。

稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。

注意：每次稀释时都必须换用新枪头。

3． 吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。

4． 吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。

5． 37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。

结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。

5.8.3 50%组织培养感染剂量法

此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。

5.8.3.1 细胞准备：

1． 收集一瓶QBI-293A细胞，计数。

2． 用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。

3． 用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。

5.8.3.2 准备稀释病毒液

1． 第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。

2． 上下吸打5次混匀。

3． 换用新枪头。

4． 从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。

5． 反复稀释至最高稀释度。

6． 用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。

7． 最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml DMEM 2%监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。

8． 37℃培养10天。

9． 10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。

10． 计算每一排中出现阳性的孔数。

如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%

阴性，则本测试即为有效。

图7：TCID50的典型结果 

稀释度孔对 照

稀释度 比率 3v q- /  2 

10-10 0/10=0 uc% ?\0jo# 

10-9 0/10=0 F78?54dN]2 

10-8 2/10=0.2 ' 7]<Qo ¬g 

10-7 6/10=0.6 HG1gai 7Z# 

10-6 10/10=1 |_?1%0rv> 

10-5 10/10=1 oQ =  | d, 

10-4 10/10=1 iE  +F ' 5 

10-3 10/10=1 D 8| *gu&o 

在这一例子中，当稀释度为10-6时出现100%阳性，当稀释为10-9时出现0%阳性。因此，滴度可以用KARBER统计法精确算出：对于100ul的稀释液，滴度为T=101+d（s-0.5）

d=log10稀释度=1（对于10倍的稀释度而言）

s=阳性比率之和（从第1个10倍稀释度开始）=1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0=6.8。

虽然一些低稀释度在测定中省略了（如10-1和10-2），但在计算时仍应以阳性比率为1来算。

滴度：T=101+1（6.8-0.5）=107.3（100ul病毒保存液中）

T=100.3≈2×108 TCID50/ml。 

说明：我们已经证实，TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7。

将TCID50/ml转换为PFU/ml：

T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml≈4×107 PFU/ml。