病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增

录入时间:2009-8-17 11:48:47 来源：青岛海博

一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在QBI-293A细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000，因此1L培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀）。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。

操作步骤：

1. 在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 QBI-293A细胞。

2. 取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释应得到的MOI值约为5。

3. 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃ CO2孵箱中培养90分钟。

4. 加入9ml DMEM5%。

5. 再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒（5.3）。

如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定（5.8）。收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后按5.8进行病毒滴定。

6. -20℃/37℃冻融3次。

7. 转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。

8. 3个175cm2培养瓶中各加入107 QBI-293A细胞进行培养。

9. 将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培

养90分钟。此时MOI值约为25。

10. 加入DMEM5%至30ml。

11. 再培养48~72小时。此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。若需要，进行MOI测定（5.3）以估计病毒滴度。此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤（5.8）。600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，按5.8章中所述进行病毒滴定。

12．移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。 S1 3ZdaHiJ

13． 30瓶175 cm2培养瓶中每瓶各加入107 QBI-293A细胞。

14．将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃培养90分钟。此时MOI值约为25。

15．加入DMEM5%至30ml/瓶。

16．再培养48-72小时，此时约有3×1011~3×1012个病毒。若需要，进行MOI测定估计病毒滴度。如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM5%中。-20℃/37℃冻融3次，离心沉淀细胞碎片。此时5ml DMEM5%中3×1011~3×1012个病毒颗粒，浓度为6×1010~6×1011vp/ml。然后按5.8章中所述滴定病毒储存液，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。在109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量。如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。比如，用第2代病毒产生第3代病毒。如果没有第2代病毒，那么必须用第1代病毒来产生新的第2代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA水平尽可能低。如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。

表5：腺病毒扩增

第一代第二代第三代第四代 21D c}GlEH

每瓶细胞数 1×105 5×106 1×107 1×107

培养瓶大小

（cm2） 75 175 175

培养瓶数 24孔板1孔 1 3 30

感染来源稀释的空斑首次扩增后的病毒保存液第二代病毒第三代病毒

每瓶接种量 0.1 mL 0.5 mL或 n d

2.5×107 1 mL 1.5 mL

总培养体积 1 mL 10 mL 90 mL 900 mL

MOI 0.01 5 25 25 A

滴度（VP/mL） 1×108~9 5×108~9 3.3×108~9 3.3×108~9

总病毒量 1×108~9 5×109~10 3×1010~11 3×1011~12

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