QBI-293A细胞的感染和病毒空斑的产生

  感染QBI-293A细胞和产生病毒空斑在这本手册的多种操作中都得到应用，其具体操作视不同的实验目的而稍有差异（如滴度测定、大规模扩增和纯化）。这一节提供了一个基本的操作说明，并详细描述了QBI-293A细胞感染后不同时间的具体变化。

5.2.1 感染QBI-293A细胞

QBI-293A细胞中腺病毒的感染周期表现为光镜下可见的细胞表型的改变，此周期始于病毒和细胞接触后。被感染细胞的表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率相关，这个比率称为感染复数（MOI）。病毒控制细胞并阻止细胞的生长需要几个小时的时间。 10~20的MOI值通常用于需要同时感染所有细胞时，此时细胞汇合率应该在90~95%左右，因为细胞在感染数小时内将停止生长。加入病毒的量可通过MOI值测定（见5.3）或病毒滴度测定（见5.8）确定。在这个MOI值条件下，被感染细胞的形态在1~2天后就会完全改变：细胞变圆并逐渐从壁上脱落（见5.2.2）。随着病毒的增殖，细胞核将占据细胞的大部分，这一表现称为细胞病理效应（CPE）。感染后3天，所有细胞都将呈现CPE。当QBI-293A细胞在MOI值为1或更低的情况下被感染，则只有一部分细胞能被感染。此时感染所有的细胞必须产生完整的感染周期并释放病毒，整个过程大概需要4天。在这个过程中，未被感染的细胞将继续生长，细胞可能在未被全部感染时达到100%汇合率而停止生长。感染后的表现是多种多样的，但典型的表现是在感染后5天可见大多数细胞呈现CPE而其余的细胞表现为原来未被感染的形态。感染的操作很简单，只要将病毒与细胞接触。为增加感染的有效性，在最初2小时感染中最好将培养液的体积减到最小，这样病毒与细胞接触得会更紧密，然后再增加培养液。此外，缓慢而持续地晃动培养板（Mittereder et al. 1996）可使病毒分布更均匀，从而使感染效果更好。 注意：处理细胞和病毒时都必须使用消毒的枪头。

5.2.2 病毒空斑形成

病毒空斑形成源于一个细胞被一个病毒感染后，经过多次完整的感染周期释放病毒再感染周围的细胞。病毒空斑的形成是一个缓慢的过程，甚至在光镜下能观察到空斑之前，细胞已经达到100%汇合。为限制病毒的扩散，通常在培养液中加入琼脂糖，但在琼脂糖覆盖下观察细胞形态的改变则要稍微困难一些。感染后7天左右可以在显微镜下看到小的空斑，表现为一定区域内细胞呈现CPE。第10天可以在光镜下看到形态完整的空斑，有经验的研究者则能凭肉眼观察到培养板底部有小的空白斑点形成。到14天，空斑可非常容易地被挑选出来。

 

5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞

将琼脂糖覆盖细胞不是一项容易的技术，你必须在琼脂糖凝固之前迅速地将它在单层细胞上完全铺匀。但是如果铺得太快太重，那么细胞往往会脱壁。但通过几次实验后，这一步应该比较容易了。琼脂糖/DMEM混合物制备：

 

1. 用无菌PBS制备5% SeaPlaque琼脂糖（FMC产品）储存液，高压消毒后每管10mL分装在50mL塑料离心管中，4℃保存。

 

2. 使用之前先在微波炉中融化5% SeaPlaque琼脂糖（避免沸腾），然后冷至45℃。防止琼脂糖沸腾最好的办法是在沸水浴中加热，如果没有完全融化的话再在微波炉中加热数秒。

 

3. 加入30mL预平衡至37℃的DMEM5% 后充分混匀，这样琼脂糖的终浓度为1.25%。立即使用。覆盖QBI-293A细胞：  在进行下一步操作之前，请确认细胞是否已贴壁完好。

1. 移去培养液，用1.25%琼脂糖/DMEM混合物覆盖单层细胞。 

2. 沿着培养板的边缘将琼脂糖轻轻加入，加入的具体体积参考表3，然后放回CO2孵箱培养。

表3：不同培养器皿应用的琼脂糖体积

培养皿大小 首次量 追加量  

100 mm 10 mL 5 mL 

60 mm 5 mL 3 mL  

6孔板 3 mL 1.5 mL