QBI-293A细胞培养

293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293作为第一代，则30代内能得到最佳结果。一旦到了30代，最好复苏一管细胞开始新的培养。所以，我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞库。

QBI-293A细胞在DMEM培养液中培养，该培养液还含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清浓度为2%~10%，视实验需要来调节细胞生长速度。为简化此操作说明，培养基描述为DMEM后加血清浓度（如：DMEM5%表示：含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、终浓度为2mM的谷氨酰胺和终浓度为5%的热灭活胎牛血清）。QBI-293A细胞需按标准的细胞培养规程进行操作，在健康状态时，它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。被感染的细胞则变圆脱落，即所谓的细胞病理效应（CPE）。所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则，这一点是至关重要的。抗生素可用可不用，但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。 

QBI-293A细胞生长的相对密度见下表：

表2：汇合率与细胞数量  

汇合率(%) 60mm培养皿 100mm培养皿

50 1.60×106 3.5×106 

75 2.40×106 5.25×106   

100 3.20×106 7.00×106  

 

5.1.1 QBI-293A细胞初始培养 

1. 将冻存的一管QBI-293A细胞在37℃水浴轻轻晃动融化。

2. 融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。 

3. 将细胞转入15mL无菌离心管中，加入10mL DMEM 10%，600×g离心5分钟使细胞沉淀。

4. 弃去上清。

5. 将细胞用10mL DMEM 10%重悬，轻轻打匀 

6. 转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。  

7. 在5% CO2孵箱中37℃培养过夜。 

8. 第二天观察细胞汇合率，若合适则可进行实验，否则按5.1.2所述继续培养。

5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 

QBI-293A细胞必须按1:10到1:20传代

1. 室温下胰酶消化1~3分钟使贴壁细胞脱落 

2. 拍打培养瓶边缘使细胞脱落，在倒置显微镜下观察细胞是否变圆，是否已从培养瓶表面脱落。

3. 按需要用新鲜培养液稀释细胞悬液，转入新的培养瓶中。在5% FBS中，细胞倍增的时间是26小时，在10% FBS中稍短一些。

5.1.3 QBI-293A细胞的冻存

建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于50%，以保证亚克隆的特定表型。

1. QBI-293A细胞必须在含10%高质量FBS的DMEM中培养。 

2. 将健康生长的QBI-293A细胞离心沉淀。

3. 以最小体积的DMEM 10%重悬细胞。

4. 用血球计数器进行细胞计数。 

5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重悬细胞，细胞终浓度为1×106/mL。

6. 无菌操作将1mL细胞悬液转入2mL冻存管中。 

7. 将冻存管放入冻存盒中，-80℃储存24小时。这一简便措施可保持约1℃/分钟的降温速率，适于冻存细胞。