细菌内AdEasyTM重组子的产生

录入时间:2009-8-17 11:44:10 来源：青岛海博

4.2.1 共转染的一般原则

1）将线性化转移载体和pAdEasyTM-1 DNA共转化BJ5183必须要用高活性的感受态细胞。试剂盒中提供的细菌为电穿孔感受态，有很高的转化效率。如果不用电穿孔法进行转化，那么必须制备化学敏感性感受态细胞，并在应用之前试验其转化活性（108已足够）。

2） DH5α不可用于转化，因其不支持重组，它只是用来扩增重组病毒DNA。

3）本实验需要2ug线性化胶纯化的重组转移载体，共转化和对照各需1ug。

4.2.2 共转化方法

同时进行实验组和对照组的转化实验：

实验组共转化：1ug线性化重组转移载体（5ul）和1.0ul pAdEasyTM-1载体（100ug/ul）

对照组转化：1ug（5ul）线性化重组转移载体 _n YG;lf

1．将BJ5183感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。将细胞分为2管，每管40ul。

2． 40ul感受态细胞中至多加入6ul DNA，且DNA必须溶于水，避免含有离子。

3．将BJ5183转入2mm电穿孔杯，防止有气泡形成。

4．按电穿孔供应商的使用说明转化BJ5183，Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：5 Ohms、2.5KV、c=3.o

5．用1mlLB重悬转化物。

6．转入15~50ml离心管中，37℃震荡培养60分钟。

7．将转化物铺3~5块 LB/Kan（50ug/ml）培养板，37℃培养24小时。建议分别铺100、300和600ul，以提高至少在一块板中得到可分离菌落的机率，应该得到40~100个菌落。

8．挑出24个最好的克隆，转入2ml LB/Kan（50ug/ml）培养液中培养10~15个小时。不要储存BJ5183培养液，因有可能产生非目的重组子。尽快抽提重组AdEasyTM质粒.

9．用传统碱裂解法小量制备质粒，取一半进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，验证超螺旋质粒的大小。玻璃珠或树脂制备质粒的试剂盒应避免使用，但粘粒DNA抽提试剂盒可以用。重组质粒大小约40kb，由于它是低拷贝质粒，所以小量制备时应相应调整具体操作。

4.2.3 预期结果

20%以上的菌落应含有大质粒（近40kb），这些是侯选重组子。与对照培养板生长的菌落进行对照即可大概估计线性化转移载体再连接所致的背景强弱。由于在此高效重组recA+细菌中重组转移载体会形成多聚体，因此背景将表现为一个梯度。