三、朊病毒 朊病毒是亚病毒中又一类重要感染因子，侵害动物与人类。因其主要由蛋白质构成，迄今尚无含有核酸的确切证据，故暂定名为朊病毒(Virino)或蛋白侵染子(Prion)。 由于对各种朊病毒的本质的了解不够，采用“因子”命名，例如痒疫因子和牛海绵状脑病因子等，似乎较为恰当。
1.病原性概述 在植物上，新的类病毒正在被不断发现，但在动物中，却从未发现过类病毒及其引起的疾病。然而人和动物存在着一类被称为亚急性海绵样脑病的中枢神经系统疾病，包括人的库路病(Kuru)、克雅氏病(CreutzfeldtJakob disease)、 阿耳茨海默病(Alzheimer disease)、格史氏综合症(GerstmannStraussler syndrome)、羊的痒疫(Scrapie)、水貂传染性脑病(Transmissible mink encephalopathy)、黑尾鹿和糜鹿的慢性消耗病(Chronic wasting disease of mule deer and elk)以及牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalpopathy)。这些疾病具有一些共同的特性：
(1)潜伏期长，一般为几个月、几年甚至十几年以上；
(2)机体感染后不发热，不出现炎症症状，也不发生特异性免疫应答反应；
(3)临床上出现进行性共济失调、震颤、痴呆和行为障碍等神经症状；
(4)病程缓慢进行，但均终于死亡；(5)病理剖检变化以脑灰质的海绵样变为特征。
(1) 库路病：又称震颤病，是1966年确定的第一种人类亚急性海绵样脑病。发生于巴布新几内亚Eastern Highland省局限范围内的一个称为Fore的部落中。患者首先出现共济失调和震颤等小脑症状，随后瘫痪死亡。病理学变化主要表现为严重的神经原变性和丧失、胶质增生和灰质海绵样变。这种病是由于该部落人有吃死人脑和死人肉的习俗而传播的。随着这一习俗的废除，库路病已经得到有效控制。
(2) 克雅氏病：即CJ病，又称传染性早老痴呆，最早发现于1920年，但到60年代后期才被确定为是由非典型病毒引起的中枢神经系统传染病。欧美克雅氏病的发病率约百万分之一，似有一定的家族性。我国1986年才有首例尸检报告，某些医院的神经科病房中也已有了可疑患者。患者肌阵挛，共济失调，嗜眠，出现进行性痴呆。病灶变化与库路病相似。应用人源或动物源的生物制剂可能是克雅氏病传播的一个重要途径。20多年前，美国应用人源垂体激素治疗垂体功能缺陷患者，由于原料(尸体脑垂体)中可能混有克雅氏病患者的脑垂体，从而使接受治疗的患者遭受了感染。从1982年以来，在注射过这种制剂的患者中成批地出现了克雅氏病。本病似乎还与吃食污染有痒疫因子的羊肉，特别是羊脑有一定关系。来自以色列的一个统计，发现喜食羊脑的利比亚犹太人和南非犹太人，其克雅氏病的发病率比不吃羊脑的欧洲犹太人高30倍。但是另一些移居以色列的地中海人和北非人也同样喜食绵羊的上述组织，克雅氏病的发病率并不增高。 克雅氏病的发病年龄平均为65岁，很少发生于青年人，但最近英国发现的10个病例 ， 平均年龄只275岁，甚至有几个十几岁的少年。有人推测可能出现了一种新型的克雅氏 病。
(3) 阿耳茨海默病和格史氏病：是人类另外的两种亚急性海绵样脑病。前者具有与老年性痴呆相似的病理学变化，可能是克雅氏病另一临床病理型。格史氏病是由左侧角回病灶所致的左右失认、计算不能和右侧偏盲症。
(4) 痒疫：是绵羊和山羊中枢神经系统的一种慢性进行性疾病，又称痒病或搔痒症。早在18世纪中叶就发生于英格兰，随后传播至欧洲许多国家。二十世纪30～40年代报道于北美，蔓延至世界许多地区。我国于1983年从英国进口的羊群中发现疑似病例，组织学检查符合痒疫特征。潜伏期长达1～5年，于发病早期，病羊易惊，头高举，行走时高高举步；头、颈或肋腹部发生震颤；用手抓搔时常可使其发生咬唇反射。多数病例出现搔痒症状，病羊体温正常，且照常采食，但日渐消瘦；运动失调，后肢更为明显，病羊不能跳跃，常反复跌倒，最后完全不能站立和走动。病期为几周至几个月， 几乎100％死亡。尸体肉眼病变不明显， 病理组织学上的突出变化是中枢神经系统的海绵样变性，大量神经元发生空泡化，特别是在纹状体、间脑、脑干和小脑皮层最为明显。神经元胞浆内含有许多空泡，形成所谓的“泡沫细胞”。痒疫具有比较明显的家族史倾向，某些品种的绵羊如英国Suffolk品种，比另一些品种的绵羊易感。 病羊全身组织中均含有病原体，经脑内、皮下、腹腔和肌肉内接种途径，也易使小鼠、大鼠、仓鼠以及水貂和猴等实验动物感染，一般经4～8个月的潜伏期后发病，出现类似于自然病例的中枢神经系统症状，病情逐渐增进，并终于死亡。病绵羊与易感山羊接触，可将痒疫传给山羊，出现痒疫症状，人工感染的小鼠与健鼠接触，也可使后者感染发病。感染母羊对胎儿的垂直传播途径早已被肯定。
(5) 水貂传染性脑病：是成年貂的一种类似痒疫的疾病。病理学特征也是慢性进行性脑海绵样变性。潜伏期8～18个月以上。病貂在临床上首先表现为高度易惊， 继而奋力啃咬，运动失调，最后嗜眠和昏迷而死。病貂脑组织内含毒量极高，脑内、肌肉接种或经口喂服都可使敏感貂感染发病，也可实验感染绵羊、山羊、仓鼠和猴等动物。有人认为，水貂不是本病的自然宿主，而是因吃食痒疫病羊的肉或脏器等而遭致感染的，但是流行病学调查证明，本病更可能因水貂之间的互咬而传播。
(6) 鹿慢性消耗病：1978年，美国Colorado的黑尾鹿群中发现一种慢性消耗性疾病。其临床症状和神经系统的病理变化，与羊的痒疫极为相似。人工接种健康黑尾鹿亦已成功。后来(1982)又在附近的麝鹿中发现这样的疾病。
(7) 牛海绵状脑病：1985年南英格兰的牛群中发现一种海绵样脑病，俗称疯牛病，至19 95年5月，英国饲养的约15万头牛感染或可能感染了本病。初步认为是牛吃食了病牛或污染痒疫的肉骨 粉而发生的。本病现已发现于欧洲多数国家，加拿大、阿曼和苏丹等也从英国进口的牛中发 现了本病。潜伏期25～8年。病牛易惊，对声音和触摸反应过敏，行动异常，运动失调， 起 站后后肢叉开，步样蹒跚。晚期不能站立，并因衰竭而死亡。病程1～3个月。病变以中枢神 经系统灰质部形成海绵状空泡为特征，发病牛的年龄为3～11岁，但多见于3～5岁的成年牛 。 迄今尚无牛→牛或羊→牛间传播的确切证据。应用病牛脑接种小鼠，可以使其感染发病 。 1994年2月以来，英国发现12例克雅氏患者(包括最近发生的2例)，并已死亡8人。据 英国海绵状脑病咨询委员会的调查、分析，认为这些病例同1989年禁止食用特定牛内脏之前同疯牛病接触有关。 1988年7月英国禁止用反刍动物源蛋白饲料喂牛，1995年计划屠杀和烧毁400万头牛。 许多国家，包括我国，亦已开始禁止从英国进口牛肉和牛肉产品。 根据现有的一些证据，在人和动物的这些疾病之间存在着密切的联系。有人甚至武断地认为，克雅氏病和水貂传染性脑病等可能都来源于痒疫，将克雅氏病患者或痒疫病羊的脑组织接种山羊，都可使其发生在临床和神经病理学上与自然痒疫相似的实验感染。将痒疫因子感染水貂，则引起与水貂传染性脑病无异的疾病。如上述，牛海绵状脑病主要是因吃食污染痒疫骨粉所致。
朊病毒除可在表中所述的实验宿主体内增殖传代外，痒疫因子已成功地在小鼠神经细胞瘤细胞系内增殖，并已传代。
2.特性与本质 由于痒疫因子易于人工感染小鼠和仓鼠，并能顺利传代，因此关于朊病毒特性和本质的研究，大多来自痒疫因子。 痒疫因子对理化学因素具有异常的抵抗力，其对紫外线照射的抵抗力比常规病毒(即真病毒)高40～200倍，比马铃薯纺缍形块茎病类病毒高10倍， 其对离子照射的抵抗力，亦明显高于常规病毒。对化学灭活剂的抵抗力也高，37％甲醛溶液处理4小时，不能使其完全灭活。对非离子型去污剂，例如NP40和去氧胆酸钠等具有极大抵抗力。核酸酶不起灭活作用。羟胶和二价阳性锌离子也不起化学修饰作用。但是1M氢氧化钠、05％次氯酸钠以及1％十二烷基硫酸钠加2巯基乙醇却可使其灭活或大致灭活。蛋白酶K是蛋白质中很少有能抵抗的蛋白酶，但是应用温和性去污剂由感染脑乳剂中抽提纯化的痒疫因子却对其具有极高的抵抗力。以凝胶电泳、蔗糖梯度密度法或强力去污剂提取的痒疫因子，可在长时期的蛋白酶K作用下灭活。人们认为，这是由于痒疫因子蛋白易于 集聚或不溶于去污剂中的缘故。 由于迄今没有证明痒疫因子中存在核酸，DNA酶和RNA酶等不呈现核酸酶灭活作用，痒疫因子又对许多理化学因素呈现很高的抵抗力，因此人们推测痒疫因子可能只是一种蛋白质，或者核酸极小，且被很好地包藏于蛋白内部，从而得以抵抗上述物理学照射和化学剂的灭活作用。 Prusiner等采取痒疫因子感染的仓鼠脑组织，应用Triton X100/去氧胆酸盐抽提、聚乙二醇沉淀、核酸酶和蛋白酶消化、胆酸盐/十二烷基肌氨酸钠抽提、硫酸胺沉淀、Triton X100/十二烷基硫酸钠抽提、在连续蔗糖梯度中沉淀、蛋白酶K处理、十二烷基硫酸钠抽提以及高效液相柱层析等一系列提纯手段，分离获得一种特殊的糖蛋白，分子量为27 000～30 000kDa，称为PrP，即蛋白酶抗性蛋白(proteinase resistant protein )。PrP在一定条件下形成杆状结构或纤维状结构。后者就是可在电镜下看到的所谓痒疫相关纤维(SAF, scrapie associated fibrils)。SAF发现于自然感染和人工感染痒疫的绵羊脑组织内，而且也见于克雅氏病、格史氏病和库路病患者以及牛海绵状脑病的脑组织内。SAF宽4～6nm，长50～500nm。因其具有特异性，故可作为痒疫类疾病的病理学诊断指标。但也有人认为SAF只是一种感染产物，而不是感染因子本身。 那末SAF与PrP的关系如何? 学者们认为，PrP是SAF的主要组成部分，因为应用蛋白印迹技术(westernblot)可以发现SAF中含有PrP，抗PrP抗体能够修饰不同毒株来源的SAF。SAF似乎是与细胞膜相关的PrP所组成，在用去污剂抽提时，PrP以SAF的形式出现。 根据蛋白印迹分析结果，最近发现未感染动物细胞膜成分中存在着与PrP具有相同抗原决定簇的正常成分。但是这种正常细胞成分因对蛋白酶K敏感而可与PrP相区别。因此，制备SAF标本或提纯PrP，应该应用蛋白酶K消化手段，以期除去对蛋白酶K敏感的许多组织蛋白。
由于PrP的氨基酸序列已被部分测出，约250个左右的氨基酸，所以有可能构建寡核苷酸 探针和cDNA文库。 令人深感兴趣的是，从正常动物组织中很易测到PrP mRNA。 随后发现PrP基因是一个单拷 贝基因，具有2个外显子和1个很大的内含子，在正常和不正常(痒疫相关)的PrP基因或mRNA之间似乎没有差别。因此， 痒疫相关PrP是由大多数细胞均有的一个正常内源性基因编码的。正常脑组织和痒疫脑组织中这种蛋白的差异表现在PrP本身的理化学性质上。 在正常脑组织中的去污剂抽提物中，PrP不能聚集成大分子的纤维样结构，且对蛋白酶K高度敏感。相反，痒疫感染脑中的PrP聚集成电镜下可见的大分子纤维样结构，且在温和性去污剂溶液中对蛋白酶K具有抵抗力。但将SAF溶于十二烷基硫酸钠等强去污剂中，则将分解成为33～35kDa的多肽，且可被蛋白酶K所完全消化。 如本书第四章所述，正常动物脑组织提取物中存在着PrP的异构体，分子量为33 000～35 000，称为PrP33～35c。PrP33～35c在组成上与痒疫因子PrP27～30 的前体PrP33～35，即PrP33～35sc相同。两者的主要区别在于对蛋白酶K的 敏感性： PrP33～35c对蛋白酶K敏感，而PrP33～35sc对蛋白酶K具有较高抵抗力。 根据以上研究结果，特别是一些新的发现，学者们对痒疫因子的本质提出了诸多解释，归纳起来主要有“唯蛋白论”和“核蛋白论”两种说法。前者认为，痒疫因子没有核酸，只是正常宿主PrPc蛋白的修饰形式；后者认为，既然痒疫因子存在许多不同的毒株，呈现不同的表型，那就证明必然有核酸作为其组成成分。1991年Weissman提出了统一这两种假设的所谓联合学说。按照这一学说，痒疫因子感染组织的粗提物中的感染因子，即“完全朊病毒”(holoprion)，由两个成分组成，其中一个成分是PrPsc， 即使没有核酸，PrPsc也能致发疾病；另一个成分是核酸，可能存在许多变型，并因修饰P rPsc的生化特性而决定后者的株特异性，这种核酸可能正常地连结于PrPsc上， 但也存 在于未感染的宿主细胞中。没有核酸的PrPsc侵入细胞后，可能激活某个细胞核酸， 使 其呈现朊病毒核酸的作用。朊病毒核酸借助正常细胞酶(聚合酶)而复制，这一过程由PrPs c所激发，甚至可能依赖PrPsc的存在。因此，PrPsc是致病成分，但其原始结 构由宿主基因所编码，而朊病毒核酸则是传播性遗传成分。 无论是完全朊病毒或PrPsc，在侵入敏感细胞后，均可发生增殖过程，
3.发病机理 淋巴网状内皮系统可能在痒疫的发病机理中起着重要作用。以感染羊脑组织接种小鼠，最早可在脾脏、外周淋巴结、胸腺、肠管和唾液腺中检测到痒疫因子，脑和脊髓是最后感染的器官。但是最近报道，在经一定阶段的潜伏期后，感染因子集中存在于中枢神经系统。经皮下、腹腔或静脉等外周途径感染后，脾脏是痒疫因子复制的最初部位，至少在啮齿类是这样。切除脾脏可以延长潜伏期，但不能阻止痒疫的发生，说明其他脏器，如内脏淋巴结等也可作为痒疫因子增殖的原发部位。在脾脏中增殖后，痒疫因子沿内脏自主神经轴索内途径到达中枢神经系统，最初限于胸部脊髓，随后向头侧和尾侧方向扩展。也不排除血源性散布的可能性，因在痒疫和克雅氏病实验感染的小鼠和仓鼠体内，均在血液和血清中发现感染因子。实验感染山羊体内感染因子的分布与小鼠相似，但时间较长。 综合以上实验研究结果，经口途径发生的自然感染，始发部位可能是咽淋巴组织，随后再向淋巴网状组织扩散，或者最初感染发生在远端小肠和近端结肠，随后再向脾脏和内脏淋巴组织扩散。 痒疫等朊病毒感染导致神经原纤维束、淀粉样原纤维、痒疫相关原纤维(SAF) 和淀粉样斑等的形成。这些病理产物在化学和免疫学上与神经元中的一种10nm神经丝相关。由于朊病毒干扰这种神经丝的产生，导致神经丝在核周体内堆积以及神经元溶解，或者启动不正常神经丝的产生，导致淀粉样原纤维和淀粉样斑的形成。 早期研究发现小鼠基因能够影响痒疫的潜伏期。后来证明一个特殊基因sinc对潜伏期具有明显影响。最近发现编码PrP的基因紧密联锁于影响潜伏期的一个prni基因。prni基因可能就是上述sinc基因。迄今尚未完全阐明prni或sinc基因本身是否就是PrP的结构基因，或者只是位于这一结构基因近傍的一个基因。主要组织相容性复合物(MHC)的H2位点也可影响痒疫的潜伏期，但并不与sinc或prni基因联锁。
4.诊断 由于痒疫等朊病毒感染不诱发动物机体产生免疫反应，故在临床发病以前，很难检出感染动物。但是潜伏感染和临床前期的感染动物却是扩散疫病的重要传染源。因此，为了减少动物之间的传播，必须建立有效的诊断方法，以期尽早发现和淘汰感染动物。 由于没有血清学诊断方法，现在进行诊断的主要根据是临床症状(持久的疾病经过、临床发病动物几近100％的死亡率以及各该疾病的特殊症状，如痒疫的搔痒等)、病理组织学变化(脑的海绵状变性和神经元空泡化等)以及生物学试验。 患病动物丘脑、中脑和脑干内含有高浓度的感染因子，将这些组织的乳剂脑内接种小鼠，可在13～20个月内使其发病，并可再以小鼠材料进行传代，潜伏期缩短至5～7个月，甚至4～5个月。 1988年，Satoshi等以相当于痒疫朊病毒蛋白N端一个区域的人工合成多肽， 制备抗血清，采用蛋白免疫印迹技术，不仅成功地检出了痒疫感染小鼠脑组织中的少量痒疫相关纤维(SAF)蛋白，而且也可在脾脏和淋巴结标本中检出这种蛋白。 小鼠在腹腔接种痒疫因子4周后，脾脏标本就可呈现阳性反应，从而为临床前期的感染动物的检出提供了一个可能手段。这一方法的缺点是被检标本的制备技术比较复杂，感染组织经乳化、冻融和超声处理后，还需经过DNA酶、去污剂和蛋白酶K以及超速离心沉淀等操作， 才能取样作电泳和蛋白免疫印迹测定。 1991年，Ikegami应用兔抗绵羊PrP多克隆抗体，通过蛋白免疫印迹技术，在已呈现痒疫症状的6头自然感染绵羊的中枢神经系统、脾脏和淋巴结标本中，分别在5头、 4头和3头检出了PrP。对47头临床健康绵羊也作了PrP的检出试验，结果在39头被检绵羊中，从3头的脾脏和淋巴结中检出了PrP。 根据上述结果，应用抗PrP抗体进行蛋白印迹试验， 有可能成为检出临床前期感染动物的一种方法。但是必须指出，被检标本必须应用蛋白酶K处理，以免出现因健康动物细胞膜成分中正常存在的PrP类似物，导致假阳性反应。Prusiner等应用以SDS-PAGE提纯的仓鼠PrP27－30制备兔抗血清，据云在蛋白印迹和免疫斑点检测中表现良好的特异性。
5.控制 迄今尚无预防朊病毒感染的疫苗。一般采取屠杀发病动物以及与发病动物有接触史的动物，控制本病的进一步流行，销毁尸体。制订育种计划时，不仅要淘汰产生患病后代的公羊和母羊，而且淘汰其所有后代。加强海关检疫，严禁从疫情发生地区引进种畜。 培育对痒疫等朊病毒感染具有抵抗力的动物品种，可能是防制此类疫病的有效途径。
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