(2) 血清学诊断：习惯用细胞中和试验和琼脂扩散试验检测抗体。虽然不同毒株之间存 在较高程度的交叉反应，但在细胞培养物中的病毒中和试验确实可以反映不同毒株的某些 特性。琼脂扩散试验则完全是群特异性的，不能鉴别毒株，甚至难于辨别BVDMD病毒 抗体及其相关的其它动物病毒，例如猪瘟病毒的抗体。
① 病毒中和试验：用犊牛睾丸或犊牛肾的原代或继代细胞培养物制备病毒液。 当 细胞即将长成单层时接种俄勒冈C24V毒株，在细胞发生明显细胞病变时收获病毒 液， 反复冻融2次。经2 000r/min离心沉淀15分钟，吸取上清液作为病毒液。滴定效价后冰 冻保存备用。 被检血清、阳性对照血清和阴性对照血清均须先经56℃水浴灭活30分钟。 本试验时先将已知滴度的BVDMD病毒，用含抗生素的Hanks液(pH71～72) 稀释成 每01ml含病毒100TCID50。再将被检血清作连续的倍倍稀释。在每一稀释度的血清中 加入等量已稀释的病毒，置37℃温箱感作一小时，其间轻轻振荡数次。取出后接种牛 睾丸或牛肾细胞，每份4管(瓶)细胞，每管接种血清病毒混合液02ml。置37℃ 吸附2小 时后，加入维持液1ml，37℃继续培养7天，定期检查细胞病变，并判定结果。 每批试验必须设置下列对照组，每组4管，在同样条件下培养检查：a 病毒含 量滴定管；b 每份被检血清(1∶8)对细胞的毒性检查管；c 阳性对照血清+等量100TCI D50/01ml的病毒管；d 阴性对照血清+等量100TCID50/01ml的病毒管。 培养检查6天，如各项对照细胞管符合预定要求，则被检血清在1∶8稀释时能中和50% 或50%以上细胞培养物使其不出现CPE者，判为阳性。 上述试验也可在微量滴定板中进行。
② 琼脂扩散试验：琼脂扩散试验只能粗略测定被检血清中的抗体， 其敏感性不如血 清中和试验，如上述，琼脂扩散试验测出各株BVDMD病毒中共有的群抗原，没有株特 异性。 标准抗原通常用大瓶培养的犊牛睾丸或肾单层细胞制备，即当细胞生长成单层时， 按每个细胞感染1个TCID50的俄勒冈C24V毒株的复侵率(multiplicity)进行接毒 ， 随后 置于35℃培养4天。倒去维持液，加入标准的胰蛋白酶EDTA细胞分散剂使细胞分散。离 心沉淀，取得沉淀细胞，再用小量缓冲盐水(约原培养液量的1%)将细胞作成悬液，冰冻 保存备用。临用时取出，作成一定的稀释度后与标准血清进行反应，检验其特异 性，并标定其在本试验中的最合适的确实效价。 标准血清通常由实验感染的康复猪采取，选取其中含有高价抗体者应用。这种血清 需经严格的特异性检查，并于不同稀释度下与标准抗原进行反应，确定本实验时的合适 稀释度。 如果没有高效价的阳性血清，也可应用低效价血清，经半饱和硫酸铵盐析沉淀 ， 取得球蛋白，再经PBS透析，制备合适的标准抗体。 先在平皿内的琼脂板上打孔，孔径6mm，孔间距2mm。将周围孔中最靠近平皿边缘的 一孔标记为1，并按顺时针方向将其它各孔标记成2～6。标准抗原滴入中央小孔， 标准 血清滴入1、3、5孔内，将被检血清分别滴入2、4、6孔。 滴样后将琼脂板置湿匣内于室温下感作24小时判定。阴性反应及可疑反应孔应延长 至48小时，再作一次终判。 ++++＝被检血清的沉淀线比标准线强； +++＝被检血清沉淀线的强度与标准线相等； ++＝被检血清的沉淀线比标准线弱； +＝标准沉淀线的末端发生明显的弯曲； ±＝标准沉淀线的末端弯曲不清楚。 与标准沉淀线发生交叉者为非特异性沉淀线。 如上述，琼脂扩散试验仅能粗略地测定被检血清的效价，而血清中和试验则可准确 测出血清的滴度。Hopkinson等用细胞抗原检测164份牛血清，发现中和试验 中滴度在1∶8以上的血清，琼脂扩散试验全部阳性；2份滴度为1∶4的血清， 琼脂扩散试 验为阴性；23份滴度低于1∶2的血清，琼脂扩散试验全部阴性。
③酶联免疫吸附试验：最好应用MoAb, 可将BVDV或其抗体与其它病毒或抗体区别开来。作为常规方法检测器官或组织培养中的BVDV或监控牛群中BVDV的抗体水平 及潜伏感染情 况的一种技术，对鉴定和清除畜群中BVDV感染动物是很有价值的。
上一篇：粘膜病病毒诊断
下一篇：粘膜病病毒免疫
海博微信公众号
海博天猫旗舰店
