诊断 口蹄疫的临床诊断根椐症状，亦即口和蹄部的水疱和烂斑， 并考虑流行病学材料。由于口蹄疫、水疱性口炎、水疱疹和猪水疱病等4种疾病极为相似 ，故应首 先加以鉴别。如果补体结合试验和免疫保护试验不能作出最后结论，则应进行病毒理化学特 性鉴定、细胞感染范围试验以及动物接种试验，见表16—11。在已确定为口蹄疫病毒之后， 再作型和亚型的鉴定。毒型鉴定包括生物学和血清学两种方法。生物学方法是用牛、豚鼠或 乳鼠进行交叉免疫试验以及应用豚鼠和乳鼠进行血清保护试验。血清学方法包括补体结合试 验、中和试验和琼脂扩散试验。(1) 病毒的分离：自患畜病料中分离病毒，是最可靠的 诊断方法。通常应用实验动物、鸡胚和组织培养细胞。病料的采取与保存是否恰当，直接 影响分离的成功率。一般采取水疱皮和水疱液作为病毒分离材料。牛应采取舌表面的水疱皮 ，蹄叉和蹄冠部的水疱皮常有比较严重的细菌污染。猪则采取鼻突部或蹄叉间、蹄冠的水疱 皮。水疱皮应早期采取，亦即选择新鲜未破溃的水疱。已经溃烂或腐败的水疱皮不宜作病毒 分 离用。水疱皮必须同时采自几头病畜：牛2头以上，猪5头以上。采取后立即投入50%甘油磷 酸盐缓冲液内，并迅速冷藏。水疱液在无菌条件下采取，可用灭菌的1～2ml注射器直接由未 破溃的水疱内抽取。也可应用食管探杯(cup probang)采集牛羊的食管-咽头分泌液， 每次 5ml，采集后立即加入等量的细胞培养用维持液，并剧烈振荡1分钟后应用或保存备用。 表16-11口蹄疫病毒与三种水疱性病毒的区别 口蹄疫病毒 水疱性口炎病毒 猪水 疱疹病毒 猪 水疱病病毒 (一)归属
欲将病料送至远处检验时,应将其置于盛有冰-盐混合物的保温瓶。①应用实验动 物的病毒分离法:常 用乳鼠和豚鼠分离与鉴定病毒。 乳鼠接种 〓将病畜水疱皮置于平皿内,以 灭菌的pH76磷酸盐缓冲液冲洗4~5次,并用灭菌滤纸吸干。称重后置于灭菌乳钵中,剪碎,加 入适量海砂磨成糊状。按水疱皮重量加pH76的磷酸盐缓冲液制成1:5的悬液(悬液浓度可按 实际情况适当增减)。如有水疱液,可在此时加入。为防止细菌污染,每ml加入青、链霉素各1 00 0单位,置2~4℃冰箱内浸毒4~6小时,然后以3 000r/min的速度离心沉淀10~15分钟,吸取上清 液 备用。取4~7日龄乳鼠10只,于颈背部皮下接种上述病毒感染液02ml。自接种后18小时开 始,每隔1~2小时检查一次。如果病料内含有口蹄疫病毒,被接种乳鼠一般在接种后20~30小时 出现典型的口蹄疫症状。发病乳鼠运动不灵活,用镊子夹尾巴或四肢,常可发现其已失去知觉 。随后四肢麻痹,呼吸促迫,最后死亡。如于注射后12小时内死亡,则多因注射技术不佳或其 它非特异感染所致。选出发病死亡的乳鼠,用01%新洁尔灭或2％石碳酸溶液浸泡30分钟, 随后将其仰卧固定于盛有石蜡的平皿或木板上,再用75％酒精棉球消毒皮肤。由正中线剪开 皮肤,并向四肢延伸,剥离皮肤,除去头、四肢以及胃肠和膀胱等,采取骨骼肌作为接种材料。 将其研磨后制成10％悬液作传代接种用。 豚鼠接种 〓水疱皮的处理方法同 前。选择400g体重以上的健康豚鼠3～5只,先剪去后肢跖部边缘的被毛,以75％酒精棉消毒接 种部位,再以灭菌的干棉球擦干。用注射器和5号针头抽取接种液,在豚鼠两后肢跖部皮内垂 直穿刺6针,横行穿刺4针,皮内穿刺注入感染液02ml,再于跖部皮下注入02～04ml。感 染豚鼠一般在接种后36~48小时于接种部形成口蹄疫的特征性水疱,严重时起立困难。②应用鸡胚的病毒分离法:以静脉注射为最易感。选用12～14日龄的鸡胚。在暗室内用 照卵灯找到较粗的静脉,并用铅笔标明其位置和血流方向。以75％酒精棉消毒后,用锉或烙印 器在卵壳上锉出或烙出一个2～3mm宽、5～6mm长的长方形(切勿割破壳膜)。再用外科刀将此 长方形的卵壳挑起、揭去,并在暴露的壳膜上滴加灭菌液体石蜡1滴,使壳膜透明。此时即可 见到静脉。用磨过的4号针头朝血流方向刺入静脉内,注射1∶10的病毒液002ml。如果静脉 内出现血流暂时中断,静脉呈白色,则即证明确已注入静脉。将卵壳缺口用蜡纸或胶布封固后 ,置36～365℃温箱中孵育。每隔24小时检查一次。在接种后24小时内死亡者弃去。选取于 接种后72～96小时内死亡的鸡胚,于0～4℃冰箱中静置4～10小时,随后采胚,除去头和爪(一 般见不到鸡胚病变),用肌肉作下代接种材料。如果鸡胚健活,也在接种后96小时采胚,如上处 理后盲传。③应用组织培养细胞的病毒分离法:口蹄疫病毒可在牛舌上皮、牛肾、猪肾、 豚鼠肾、仓鼠肾和兔肾等原代细胞以及猪肾和乳仓鼠等细胞系内增殖。将病毒材料置于乳 钵内用灭菌剪刀剪碎,并加适量玻璃砂或海砂研磨均匀,加入pH76的磷酸盐缓冲液制成1∶3 的悬液。滴加抗生素溶液,使每ml悬液含青、链霉素各100单位。再按悬液量加入20％氯仿, 置0～4℃冰箱中浸毒4～6小时。以2 000r／min的速度离心沉淀10～15分钟,吸取上清液,供 组织培养细胞 的感染用。选择已长成单层的细胞管,吸出旧营养液,并以Earle氏液冲洗2次,每管接种病 毒材料005ml,置37℃温箱中吸附60分钟,随后再加不含牛血清的维持液095ml(pH为76 ～7 8)。继续置37℃温箱孵育。在接种后24小时开始用低倍显微镜观察有无细胞病变出现。一般 在接种后36～48小时即可出现比较明显的细胞病变。吸出感染细胞培养液,置-20℃保存 或作传 代和病毒鉴(滴)定。(2)病毒型的鉴定:通常应用O、A和C等各型标准阳性血清进行补体 结合试验,鉴定上述分离的毒株或者直接用以鉴定病畜水疱皮内的病毒抗原。应用补体结合 试验鉴定水疱皮内的病毒抗原,常可在2～3小时内得出结果,故是目前普遍应用的方法。鉴定 口蹄疫病毒及其型,也可应用琼脂扩散试验、中和试验、酶联免疫吸附试验和交叉免疫保护 试验。
①补体结合试验反应原理和基本术式与一般补体结合试验相同, 请参阅本书第十 四章有关节段。
补体的工作量是滴定度再加1 ％(习惯上叫二个单位)。如滴定度为02ml,也就是在一个剂量内含2％的纯补体,则其工作 量 应该是3％。本试验更要用四个补体量。如果2单位是3％,则其余三个量为:3单位是35％,4 单位是4％,5单位是45％。故在此条件下,补体的滴定度不能低于025ml,否则5％(即1∶2 0 )的补体就不能用了。 标准阳性血清 〓系用豚鼠制造,即用各种口蹄疫病毒 的豚鼠适应株多次免疫而得。因A和O型病毒常可引起100％或将近100％的死亡,所以需先进 行基础免疫。选取体重500g以上的豚鼠20只,第1次股内侧皮下注射10-4稀释病 毒液0 5ml,3～4天后注射同样稀释度的病毒液06ml,再隔3～4天,皮下注射10-3稀释 病毒液 04ml。并于末次注射后7～10天以10-2稀释的病毒液皮内注射两后肢的跖部皮 内。豚 鼠大多发病,但经2～3星期后痊愈,此时再作高度免疫注射。也可先用氢氧化铝甲醛灭活疫苗 作股内侧皮下注射2ml,脚掌皮内注射02ml,14天后以10-2强毒皮内注射两后肢 跖部,豚鼠可能发病,待其痊愈后,再作高度免疫注射。高度免疫注射时,以10-1 稀释的 病毒液皮内注射于两后肢跖部,共4～5次,每次间隔3～4天,第1次02ml,以后逐渐增加,最后 一次注射05～06ml。于末次注射后7～8天心脏放血,析得血清,56℃30分钟灭活,并加入0 1 ％杞奴锁防腐。4℃冰箱保存备用。有效期在1年半以上。C型病毒对豚鼠的致死力较低,可 直接用10-1稀释的病毒液作后肢跖部皮内接种,待其发病痊愈后,再如上述用10 - 1稀释的病毒液作高度免疫注射。
被检抗原 〓采取病牛 、病猪或人工感染的豚鼠水疱皮,以pH76磷酸盐缓冲液或生理盐水连续冲洗4～5次,用灭菌 滤纸吸干后称重,置灭菌乳钵中用消毒剪刀剪碎,其中加入适量玻璃砂或海砂充分研磨均匀, 再加二倍量的pH76的磷酸盐缓冲液,放置室温1～2小时或0～4℃冰箱浸毒24小时,取出后以 3 000r ／min的速度离心沉淀15分钟,吸取上清液,置58℃水浴中灭活40分钟,即为被检抗原。如果 是用人工感染的乳鼠,则选取其在18～48小时内死亡的,无菌采取肌肉,称量后置灭菌乳钵中, 加砂研磨成糊状,然后加pH76磷酸盐缓冲液,配成1∶2悬液,置室温中浸毒1小时,再以3 000 r／min 的速度离心15分钟,取其上清液放置58℃水浴中灭活40分钟,作为被检抗原。细胞培养病 毒可直接58℃灭活40分钟后进行检测。 标准抗原 〓用O、A和C型豚鼠适应 毒 株分别接种豚鼠后肢的跖部皮内,经18～24小时采取注射部位形成的第一期水疱皮,如上于乳 钵内加砂研磨成糊状,并用pH76的磷酸盐缓冲液作成10％的悬液,室温浸毒1小时,再以3000 r／min 的速度离心沉淀15分钟,取其上清液置58℃水浴中灭活40分钟,即成标准抗原。标准抗原在制 成后需以同型标准血清作效力滴定,用其它型标准血清作特异性检查。
反应时间完了后,可以立即评定结果,也可在6～12小时后再评定一次。各型血清中4管 都 全溶血,或仅第1管记“+”的,为阴性反应;补体3单位(第2管)以上,记“++++”的,为阳性反 应;仅第1管记“++++”的为可疑,需重复试验。根据以上试验结果,该被检材料为O型口蹄 疫病毒。必须指出,在口蹄疫病毒的四种抗原中(病毒粒子抗原、12S亚单位抗原、75S空 衣壳和VIA抗原),只病毒粒子抗原和空衣壳具有型特异性。在应用补体结合试验定型时,往往 由于存在VIA抗原、12S抗原而受到干扰。将待检抗原和标准抗原以58℃灭活40分钟,就是为 了消除这种非特异性干扰。提高标准阳性血清的稀释度,也有降低这种非特异性干扰的作用 。如需进一步鉴定亚型,则可应用该型病毒中的各个不同亚型的标准血清,与被检抗原和标 准抗原进行交叉补体结合试验,随后计算r值和R值进行判定。请参阅本章“抗原性”一节。 补体结合试验也可反过来,应用已知的标准抗原检测动物血清中的抗体,进行抗体型的鉴定 ,操作方法同上。
② 琼脂扩散试验 将优质琼脂配成5％浓度,15磅 高压30分钟。待自然沉 淀后,将琼脂倒于方形搪瓷盘中,凝固后切去底部杂质,并将琼脂切成3～4mm3的小块。置双 馏水中浸泡48小时,每日换水三次。再用内含1／万硫柳汞的pH76磷酸盐缓冲液浸泡4小时 以 上,移置4℃冰箱中保存备用。这样处理的琼脂,在浇制琼脂板后十分澄清,便于观察弱阳性反 应。制板时,取琼脂小块50g,沥去缓冲液,加入pH76磷酸盐缓冲液200ml,在水浴中加热溶化 , 溶化后加入叠氮化钠或硫柳汞防腐,并再加入氯化钠,使其最后含量为75％,充分混合,即成 1 %～15％琼脂凝胶,趁热分装于平皿中,直径10cm的平皿装10ml,5mm平皿装6ml,琼脂凝胶的 厚 度为03～04mm。待琼脂凝固后,用打孔器打孔,孔径为05mm,孔间距为04mm。置37℃ 温箱中孵育24小时后应用。如系优质琼脂粉,则可直接用75％NaCl溶液配制成1％琼脂。待检材料(抗原)为从水疱中吸取的淋巴液,或者采取水疱皮或其它含毒组织以PBS研磨成1∶1 0乳剂,置4℃浸出24小时,3000r／min离心沉淀10分钟后吸取上清液检查。细胞培养毒可直接 用作待检抗原。于中央孔内滴加待检抗原,周围孔内滴加各型标准阳性血清,均添加至孔满为止,再置25～30 ℃温箱中孵育过夜,次日每隔4～6小时观察一次。在抗原孔与血清孔之间出现灰白色沉淀线 者为阳性反应。沉淀线大多偏近抗原孔。通常有两条明显的沉淀线,靠近抗原孔的一条粗而 长,呈孤形,靠近抗体孔的一条短直而细。但有时出现一条浑浊而粗短的沉淀线,这是 两条线重叠的结果。如果中间孔中注加待检血清,而在周围孔中注加各型标准抗原,即可检 测抗体的型。
③ 交叉免疫保护试验 以待鉴定的病毒材料接种牛或 豚鼠等动物,待其 发病痊愈后再用已知型病毒攻击,根据保护情况,鉴定病毒的型。牛在舌面接种,豚鼠在后肢 跖部接种。经14～21天待动物发病痊愈后,将其分成几组,每组至少二头,再用已知O、A、C等 型病毒分别攻击,接种部位及方法同上。每组另设对照二头。经攻毒后观察7天,如“O”型组 的两头不发病,而对照动物和“A”、C型组均发病,即可认为待鉴定材料中含有“O”型病毒 。也可应用乳鼠进行交叉保护试验,即取乳鼠3窝各10只。3窝分别注射O、A、C型标准血清,6 ～24小时后,以待鉴定病毒材料攻毒。根据保护结果,判定毒型,具体方法参阅本书猪水疱病 病毒“诊断”节。
④ 中和试验 应用A、O、C型的标准血清,与待鉴 定病毒悬液混合并感作 后,接种乳鼠或敏感细胞培养物。具体操作方法请参阅本书第十四章有关节段。
⑤ 酶联吸 附试验 (ELISA)近年来,ELISA已在口蹄疫的诊断中逐步代替补体结合试验以及 中和试验。 检测田间样品时,ELISA的敏感性高于补体结合试验;对于含毒量较高的样品,例如新鲜的水疱 皮和细胞培养物,可在2～4小时内获得结果。应用预先在实验室内包被的免疫反应板以及冻 干剂,将更便于现场检测。根据检测目的的不同,可用双抗体夹心法及其变法进行病毒抗原 的检出,也可应用阻断夹心法等测定血清中的病毒抗体。英国Pirbright实验室应用免疫牛群 血清,对田间分离毒株与参考毒株进行比较研究,可以迅速确定流行毒株的型和亚型,乃至发 现 新的具有独特抗原性差异的毒株,从而能在最短时期内选定参考毒株或新分离毒株制造相应 的灭活疫苗。有关ELISA的具体操作技术,请参阅本书第十四章。
⑥ 核酸探针 应用口蹄疫 病毒的cDNA克隆片段,用32P或生物素等标记后制备探针,已经成功地用于检测牛食管 —咽分泌物等样品中的病毒RNA。根据标记片段的不同,可以检测各型(群特异性探针)或某一 型(型特异性探针)口蹄疫病毒的RNA;例如MoForlane(1987)报道,应用A12亚型的全基 因组cDNA以及O1、C1和亚洲Ⅰ型的VP1基因片段制备核酸探针,前者可以检出A、O、C 和亚洲Ⅰ型等各型口蹄疫病毒,而后者则可分别检出各自相对型的口蹄疫病毒。利用编码VIA 抗原的核酸片段,也能测出各型口蹄疫病毒。PCR技术的建立极大地方便了核酸探针的制备 和应用。只要正确选用恰当的核酸片段,看来完全可能制备群特异、型特异和亚型特异乃至 株特异的核酸探针。有关核酸探针的制备技术,请参阅本书第十五章第2～3节。此外,还应 用反向间接血凝、荧光抗体和放免测定技术等检测口蹄疫病毒抗原或抗体。
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