病毒核酸是人们已知的生物 遗传物质中最为简单的一种,因此病毒学家有可能比较深入地研究病毒的基因结构,这也是病 毒遗传学进展快于遗传学其它领域的原因之一。例如,目前人们已经测定了几百种病毒的 全基因序列,而在细菌中仅完成了大肠杆菌( E.coli )的全基因测序 。因此很多生物学家希望通过对病毒遗传学的研究了解生命的某些规律,以应用于包括人类 在内的其它生物遗传学研究。 (一) 病毒基因组的限制性内切酶图谱病毒基因组核酸的 碱基数在3～300kb之间。300kb以下的病毒DNA经内切酶水解,进行琼脂糖凝胶电泳染色后,可 以观察到清晰的DNA带,而其它生物染色体DNA水解后只能看到弥散的DNA带。由于病毒核酸的 这一特性,使人们可以制备准确的病毒基因组核酸酶切图谱,利用不同的内切酶切割病毒DNA, 依据切割后的片段在凝胶电泳中泳动速率不同所形成的电泳带型做出诊断。如单纯疱疹I型与II型的鉴别以及肉食兽细小病毒的鉴别诊断等。病毒基因组的限制性内切酶图谱,或称物理图谱,是指描绘病毒双链DNA上各种不同限制性内切酶的酶切位点分布情况、限制性片段大小及其排列顺序的图谱。准确的内切酶图谱是将病毒的全部DNA序列输入电脑,用特别的软件系统(如DNA star)判读序列,由电脑绘出所有已知内切酶的酶切位点。如果尚未测定某种 病毒DNA的全部序列,则需用部分消化法(partial digestion)逐一测定不同内切酶的位点。下面简要介绍部分消化法绘制内切酶图谱。绘制内切酶图谱,必须采用病毒的线状双链DNA ,进行各种内切酶的部分消化。对于单链DNA病毒要提取其复制过程中的双链中间型;部分单 链的病毒DNA,需要有DNA聚合酶Klenow片段补成双链;对于RNA病毒目前尚没有商品化的RNA限 制性内切酶(Ribozyme除外)可用于制备病毒RNA的酶切图谱,因此所谓RNA病毒的酶切图谱,实 际上是病毒RNA制备的cDNA酶切图谱。通常先将病毒cDNA克隆到质粒上,利用质粒上已知的酶 切位点进行末端标记,分离一端标记片段进行部分水解测定,得到酶切图谱。如果病毒DNA是 环 状,则必须用只有一个切割位点的内切酶将环状DNA切成线状DNA。通常提纯的病毒DNA量很少 ,要用同位素32P末端标记法标记后再进行部分酶切分析,分析方法简述如下:(1)用末端标记法,对线性化病毒DNA的2个5末端进行同位素标记,通常用γ 32PdNTP进行标记;(2)选择一种在病毒DNA上只有一个酶切位点的内切酶,将标记的 病毒DNA切割成左、右两段;(3)琼脂糖电泳分离标记的左、右两个片段,这两个片段均为 一端32P标记DNA;(4)将一种内切酶按正常工作浓度稀释10、100和1 000倍,按常规方法酶切标记的左端DNA片段,电泳后放射自显影,以决定部分消化的最适酶工作浓度和时间; (5)部分水解可以产生多种不同的DNA片段,计算放射自显影片段的分子量,即可标出所用内 切酶的切点在左端DNA片段上的位置;(6)同样的酶切测定右端标记片段;(7)用其它内 切酶进行同样的实验,以测定其切点的位置。这种方法测定的内切酶图谱精确度在 01～05 kb之间,如果在01kb的DNA片段中有两个以上相同的酶切位点,则需用DNA序列 分析 法测定准确的位点。 (二) 病毒寡核苷酸指纹图(Oligonucleotide fi ngerprinting) 目前已经发现数百个血清型的RNA病毒,此外还发现由于病毒基因 组在不断进化过程中所产生的越来越多的亚型和变异株。对同一病毒不同毒株的比较以及抗原性相似而基因结构有差别的病毒之间的鉴别诊断,如口蹄疫病毒和流感病毒等抗原变异分 析,狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等疫苗株与野毒株的鉴别等,应用常规的血清学方法(如中和 、琼扩、补反和血凝抑制等试验)往往难以奏效。然而应用寡核苷酸指纹图分析,就能容易地 区别这些即使 基因组核苷酸序列只有微小差异而遗传关系十分接近的RNA病毒株。通过比较同一血清型不同毒株的RNA指纹图就能鉴别这些毒株在遗传上的远近关系或在进化上的先后顺序,研究流行毒株的起源及其扩散的去向,毒株的变异规律及突变机率以及监控疫苗株的遗传稳定性等。 此外 ,寡核苷酸指纹图还可用于:①研究RNA病毒基因组结构的复杂程度,例如是否含有重复序列; ② 分析分节段的病毒基因组RNA;③鉴定RNA病毒基因组的重组或重排;④绘制RNA病毒的基因图 谱;⑤分析缺失干扰病毒RNA的种类和产生机制;⑥鉴定病毒mRNA的种类。寡核苷酸指纹图的基本原理是用一种核酸酶对纯化的病毒RNA(同位素标记)进行消化。通常使用核糖核酸酶T 1(RNase T1),此酶特异作用于鸟嘌呤核苷酸(G)3端磷酸,并专一切割与相邻核苷酸相连 的磷酸二酯键,产生3末端带G的寡核苷酸。所产生的寡核苷酸片段通过双相电泳分离后,进 行放射自显影,每一种寡核苷酸片段就出现象指纹一样的图谱。由于病毒不同,其基 因组的大小、G的含量和分布均不相同,所以T1酶消化后就会产生许多理化特性和大小不尽相同的寡核苷酸片段。经聚丙烯酰胺凝胶双相电泳和放射自显影后就会在X光片上出现不 同的寡核苷酸指纹图型。其基本方法如下: 1、病毒RNA制备 病毒RNA通常从梯度离心纯化的病毒粒子中提取,以确保RNA的纯度; 2、RNA的酶切消化 通常用RNase T1消化,以获得较大的寡核苷酸片段。病毒RNA加入载体tRNA至总量1 00μg,乙醇沉淀,悬浮于10μl 20 mmol／L Tris•HCl, pH74,2 mmol／L EDTA缓冲液。加入10单位T1酶,100℃变性90秒,冰浴,再加入10单位T1酶,37℃消化30分钟,加入尿素至6m ol／L,加入8μl上样液(6mol／L尿素,50％蔗糖,02％二甲苯兰FF,02％溴酚兰,15mg／ml 酵母tRNA),电泳前65℃处理3分钟; 3、RNA标记 标记物为放射性同位素, 有二种标记方法:(1)体内标记法,通常在病毒培养液中(最好用不含磷的培养基)加入01 ～1mCi／ml 32 P的磷酸盐,在病毒增殖过程中,随核酸的合成而标记病毒RNA。此外, 也可在培养基中加入3H标记的核苷酸(如鸟嘌呤核苷酸),对病毒RNA进行标记。(2)体外 标记法,纯化的病毒RNA用T1酶消化,然后用(γ32P)ATP对寡核苷酸片段的5进行 末端标记,酚／仿抽提,乙醇沉淀后即可进行双向电泳和放射自显影。 4、双相电 泳 双相电泳是利用核酸分子之间因碱基组成不同而存在的电荷差异和分子大小不 同两个物理性状联合对核酸分子进行分离,其分辨率比单相电泳更高。第一相电泳通常在pH3 5的酸性环境中进行,此时核酸分子因碱基组成不同,解离水平不一致,造成所带电荷的差异 ,达到初步分离。第二相电泳改在pH中性或偏碱(pH83)的环境中进行,此时分离核酸分子主 要靠凝胶的分子筛作用,依核酸分子大小进行分离,而与核酸分子所带电荷无关。在制作寡核 苷酸指纹图时,第一相电泳常用10％的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE),含6mol／L尿素,25mmol／L柠檬酸,pH35,于同样浓度及pH值的柠檬酸缓冲液中预电泳1小时,然后上样,900V电泳,溴酚兰 泳至胶底部1cm处时可停止电泳,沿电泳方向切取每一孔样品泳过的胶条,进行第二相电泳。 第二相电泳常用22％的PAGE,含01mol／L Tris硼酸,25mmol／L EDTA,pH83。制胶时, 将第 一相电泳后切取的胶条置于第二相电泳胶底部,然后于同样的Tris硼酸缓冲液中从下往上电 泳。 5、放射自显影 第二相电泳完毕后,干胶,进行放射自显影,最后分析比较指纹图型。
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