核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一,近年来正逐渐用于病毒病的特异、敏感和快速 诊断。杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸,杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号, 则说明样品中存在病毒核酸,进而证明病毒感染的存在。待测的病毒核酸可以从病料中提取,也可以从纯化的病毒粒子提取。提取后可在膜上与探针杂交(固相杂交)。或直接在试管 的杂交液中杂交(液相杂交),此外, 也可直接在组织切片或细胞涂片上对细胞中的病毒核酸 进行杂交(原位杂交)。下面重点介绍如何建立杂交体系及适用于病毒诊断的几种杂交方法。 (一) 建立杂交体系 核酸杂交是多种环境因素与二条互补 核酸链综合作用的结果,它有较高的技术要求。了解各种组份及反应条件对杂交的影响是建立杂交体系,获得理想结果的基础。 1、温度 杂交反应中,双链核酸的变 性与复性主要是温度控制的。选择适当的杂交和洗膜温度是实验成败最关键的因素之一。杂 交反应通常在低于解链温度(Tm值)15～25℃的条件下进行。Tm值受核酸链组成(G+C) 、溶液的离子强度、pH值及反应体系是否含变性剂等的影响。在杂交体系不含变性剂的情况 下,DNA之间的杂交反应通常在68℃进行,当含50%变性剂甲酰胺, 则在42℃进行。 2、pH值杂交体系的pH在5～9的范围内对复性无明显影响。杂交反应通常在pH65 ～ 75之间进行。较高的pH值产生更严格的杂交条件。 3、盐离子浓度 体 系 中往往加入单价离子的盐,因为单价阳离子与核酸链上的磷酸基团发生静电反应,所以能降低 核酸链之间的静电排斥,维持双链DNA的稳定性。盐浓度增加,稳定性提高。杂交体系中通常 采用6倍SSC(1倍SSC为015 mol/L NaCl和0015mol/L柠檬酸钠，pH70)缓冲液。 4、变性剂 杂交体系中加入变性剂可降低Tm值,所以杂交可在更低的温度下进行 。常用变性剂是甲酰胺。 5、DNA浓度 浓度愈高,复性速度愈快。所以杂交反应中应加入足够的探针,还应尽量减少杂交体积,一般每百cm2滤膜用25ml杂交液。 6、探针长度 溶液中DNA复性率与片段长度的平方根成正比。所以用长的 探针可获得高的复性率。但原位杂交通常用较短的探针,以减少探针进入细胞并扩散到 靶核酸的阻力。 7、硫酸葡聚糖 在水溶液中,此化合物表面可吸附DNA 探针分子,从而浓缩探针,促进二条核酸链间的缔合。其10%的浓度可提高杂交速度10～100倍 。使用硫酸葡聚糖可能导致背景加深,所以一般在探针浓度过低的情况下才使用。 8、杂交时间 它受探针的长度与浓度、反应体积等因素的影响,较短的探针、较高 的探针浓度和较小的杂交体积,需要较短的杂交时间。一般来说,杂交时间通常在2～16小时。 9、预杂交 在杂交前进行预杂交,封闭非特异的DNA结合位点,降低非特 异杂交,是杂交的前提。常用的封阻试剂有非特异性的DNA(鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA)和大分子化合物(聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、脱脂奶粉等)。 10、碱基 错配 杂交中碱基错配将明显提高杂交本底,从而影响杂交结果的判定。因此杂交可在更为严格的条件下进行,如低于Tm值15℃的温度下杂交。 11、漂洗 杂交后的漂洗是减少非特异杂交,降低本底的关键步骤。通常用较低盐浓度(01倍SSC)的缓 冲液在较高温度下(如68℃)漂洗杂交膜。 (二) 核酸打点杂交 1、操作步骤 核酸打点杂交是最常用的一种杂交检测方法,是作为诊断 目的的首选方法。它是将一定量的病毒核酸(DNA或RNA)打点在固相支持膜(通常是硝酸纤维 素膜或尼龙膜)上,然后与放射性或非放射性标记的(DNA或RNA)探针进行杂交,杂交后通过放 射自显影(检测放射性探针)或显色反应(检测非放射性探针)检测杂交信号。阳性杂交信号表 明病毒核酸的存在,检测出病毒核酸就充分说明发生了病毒感染。具体操作方法如下:①裁剪一张大小适度的硝酸纤维素膜(NC膜),将膜在去离子水中湿透(不能完全湿透的膜不 宜使用),再置20倍SSC中浸泡30分钟,然后置滤纸上,室温晾干; ②取变性的病毒核酸(DNA或RNA)1～5μl点样于上述处理的NC膜上,同时点上探针同源核 酸(作为阳性对照)和非同源核酸(作为阴性对照);③室温干燥后,将点样的NC膜置80℃干 烤固定2小时;④点样膜用6倍SSC,01%十二烷基肌氨酸钠,002%SDS, 1%封阻试剂(一种 特殊提纯和处理的脱脂牛奶粉,柏林格公司生产)的预杂交液于68℃预杂交4～6小时。每100c m2膜用至少20ml预杂交液;⑤将膜用杂交液(预杂交液中加入20～80ng/ml变性的探针) 于68℃杂交12～16小时。每100cm2膜用25ml杂交液;⑥室温下用2倍SSC,01%SDS溶液洗膜2次,在68℃条件下用01倍SSC,01%SDS溶液洗膜2次,每次15分钟;⑦如果进行放 射 自显影,则在室温下用01倍SSC洗膜一次,室温干燥后,进行放射自显影;如果进行化学显色, 则进行如下操作(以地高辛显色为例);⑧用100 mmol/L Tris•HCl,pH75, 150mmol/L NaCl短暂洗涤膜;⑨100cm2的膜在20ml抗体结合物溶液中室温反应30分钟;10 重复⑧的洗涤二次,每次15分钟;11膜在100mmol/L Tris•HCl,pH95, 100mmol/L N aCl,50mmol/L MgCl2中平衡2分钟后,加入显色液,于黑暗中显色,当要求的点显出颜色时, 可用TE洗膜,终止反应。 2、操作说明 (1)从感染的动物组织、血液、分泌物、粪便等样品中提取的核酸经变性后可直接点在NC膜上,检测可能含有的病毒核酸; (2)点样量不超过5μl,如果样品中核酸含量很低,可在上一次点样干燥后在同一点重复点 样。也可用多孔抽滤加样器进行点样,其点样量可达200μl以上;(3)除NC膜外,也可用尼 龙膜载样;(4)样品或探针是RNA时,所有试剂及用品均应进行无RNase处理,而且操作要严 格,杂交后可以不必如此要求;(5)预杂交液的配方多种多样。作者经验表明,上述预杂交 液容易配制,可用于放射性和非放射性标记的DNA探针杂交。 (三) 核 酸酶保护分析法 该方法是近年来发展起来的一种新的RNA检测方法。它基于一种 液相杂交方法,即被检测RNA链与均一分子的单链探针(放射性标记)在试管中进行杂交,然后 用适当的单链核酸酶(S1核酸酶,RNA酶A和T1)水解掉未杂交的单链核酸,电泳分离后,通过放射自显影检测未被水解(被保护)的双链杂交体。与Northern分析法相比,核酸酶保护分 析法不需要固相支持膜,所以操作简便,杂交质量也不受RNA转移效率和洗膜条件的影响,而且 信/噪比大大提高,其检测的灵敏度比前者提高10倍以上。此外,还能精确定量被检RNA。核酸酶保护分析法对RNA样品的纯度和完整性要求不高,样品可以用细胞总RNA,即使轻度降解,也 不影响检测结果。采用的探针通常是单链的、但必须完全均一的DNA或RNA分子。单链DNA探针通常采用M13噬菌体系统,掺入同位素标记的一种dNTP来制备,或者采用末端标记来制备。RNA探针一般采用体外转录系统,掺入同位素标记的一种rNTP来制备(如前所述)。 1、RNA酶保护分析法(RNase protection assay, RPA) 本方法所采用的探针 是单链RNA,它比DNA/RNA杂交体稳定得多。杂交后加入适量RNA酶A 和T1,它们专一性地水解未形成杂交体的单链RNA,而探针与被检RNA杂交后形成的双链RNA则被保护,电泳分离后,通过放射自显影显示杂交信号。此方法甚为敏感,可以检测每个细胞中1～5个RNA拷贝。操作过 程如下:①取5 μl RNA样品(含量取决于被检RNA的丰度,可05～150μg),置冰浴;②加 入25μl杂交液(80%去离子化甲酰胺,04 mol/L NaCl, 40 mmol/L PIPES, pH64,1 mmol /L EDTA, pH85)稀释的同位素标记RNA探针(约1×105 cpm), 混匀并离心;③95℃变 性3 分钟后立即置42℃～50℃水浴中杂交过夜(12～16 hr);④加入300μl RNA酶消化 液(300mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris•HCl,pH74, 5mmol/L EDTA, pH75, 20μg/ml R NA酶T1, 40μg/ml RNA酶A), 于37℃温育30分钟;⑤加20μl 10% SDS,10μl 10mg/m l 蛋白酶K, 于37℃温育30分钟;⑥加2μl 10mg/ml 酵母tRNA;⑦酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,用10μl电泳上样液(80%甲酰胺,10mmol/L EDTA, pH80, 01%二甲苯兰FF, 01%溴酚兰)溶解;⑧95℃变性3～5分钟,立即冰浴。于适当浓度的8mol/L尿素变性聚丙 烯酰胺凝胶中电泳分离。最后放射自显影,判定结果。 2、S1核酸酶保护分析法 此方法类似于RPA,只是所用的探针是单链DNA(一般不用双链DNA探针);所用的酶是S 1核酸酶,它能降解单链DNA或RNA,而RNA/DNA杂交体则被保护,操作过程如下:①取05～ 150ng样品RNA,乙醇沉淀后,重溶于30μl杂交液(见RPA);②加入1×105cpm单链DNA探针 ;④95℃变性3分钟,立即置52℃水浴过夜;③加入300μl冰预冷的S1核酸酶溶液(02 8mol/L NaCl, 005mol/L 乙酸钠,pH45, 45mmol/L ZnSO4, 1000单位/ml S1核酸 酶 ),37℃水浴30分钟;⑤加入75μl终止液(25mol/L乙酸胺, 50mmol/L EDTA), 2μl 10mg/ ml 酵母RNA;⑥乙醇沉淀,用10μl上述电泳上样液溶解, 95℃变性3分钟,立即冰浴; ⑦如上述电泳和放射自显影。 (四) 核酸原位杂交所谓 原位杂交,就是保持组织与细胞形态的完整性,用核酸探针直接检测细胞内的靶核酸序列。它可以检测和精确定位胞浆内或细胞器上,胞核内或染色体上的各种靶核酸序列。该方法不需 要从组织细胞中提取核酸,对细胞中含量极低的靶序列有较高的敏感性。原位杂交是可以用于病毒感染检测的另一方法。它能检测细胞中病毒核酸的复制与表达以及病毒的传播,并对细胞中的病毒核酸进行定位;它能鉴定感染细胞中病毒基因的整合以及染色体上的整合位点。应用该方法,还能检测持续感染个体中何种组织含有病毒。除了必须对组织细胞进行固定,以保持原来的形态外,原位杂交与普通杂交方法没有大的区别 。对组织细胞固定的好坏直接影响杂交的效果,所以用于核酸原位杂交的固定液必须:①理化 性质稳定;②能很好保持细胞形态的完整;③对核酸无修饰和降解作用,并维持其在细胞内的 定位;④不阻碍探针与靶核酸的杂交,不引起杂交本底过高。符合此条件的理想的固定液有10 %甲醛、4%多聚甲醛、戊二醛和乙醇/冰乙酸(3∶1)等,其中4%多聚甲醛最为常用。病毒单链 RNA原位杂交的基本方法如下:①将组织切片附于清洁的无核酸酶污染的载玻片上,或取2 ～3滴分散的细胞悬液直接滴于载玻片上,室温干燥;②用4%新鲜配制的多聚甲醛(PBS配 )室温下固定20分钟,PBS洗二次;③不同浓度(30%,60%,80%,95%,100%)乙醇梯度脱水,切 片或涂片置于100%乙醇中,-20℃保存备用;④用1μg/ml蛋白酶K(溶于01mol/L Tris•HC l, pH80,50mmol/L EDTA), 于37℃消化30分钟,灭菌去离子水洗涤;⑤根据探针和被检核 酸性质,选择适当的预杂交液,在选定温度下预杂交30分钟;⑥然后加入杂交液10～100 μl(含同位素或非同位素标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针),杂交12～16小时;⑦用适当 的缓冲液洗涤;⑧于切片或涂片上铺以感光乳胶,进行放射自显影,或者用免疫酶法进行 显色反应;⑨显微镜下观察结果。原位杂交检测病毒双链DNA时,第(3)步后用RNA酶去掉细胞中的RNA,降低本底。第(4)步后用 乙醇脱水,置70mmol/L NaOH变性3分钟,冲洗,再脱水,最后进行预杂交和杂交。
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