病毒基因的克隆是在原核细胞中进行的。可以采用细菌质粒、粘性质粒或λ噬菌体作为载体，但最常应用细菌质粒载体，在大肠杆菌( E.coli )中进行。用于基因克隆的质粒必须具备3个主要结构特征：1、具有负责其 在宿主细 胞中自主复制的复制起始区(Ori)；2、具有克隆后便于筛选的标记基因(如对各种抗生素的 抗性 基因等)；3、含有外源基因的克隆位点。常用的质粒有pUC18/pUC19和pBR322等。pUC18/pUC 19为高拷贝质粒(120～200个／细胞)，含有多克隆位点，以可满足多种内切酶切割的DNA片 段的克隆；pBR322为中拷贝质粒(50～80个／细胞)。病毒基因克隆的目的在于：1、病毒 基因片段的大量制备；2、序列分析；3、基因表达与调控研究；4、构建病毒载体；5、制备 核酸探针等。病毒的基因组 有DNA和RNA以及双链和单链之分。在着手进行基因克隆前，了解目的病毒的核酸类型是必 要的。对不同类型的病毒，采用不同的基因克隆方法:DNA病毒可在限制性内切酶切割后直接 进行克隆；RNA病毒则必须先在试管内反转录成cDNA后再行克隆；反转录病毒可从感染细胞 中提取前病毒DNA，随后再行克隆。总的来说，病毒基因的克隆包括以下几种类型：单链DNA病毒的基因克隆 主要指细小病毒科成员。这类病毒的基因组为 单链线状DNA,两端因回文序列而形成发夹结构，这一结构是病毒基因组复制的引物，因此 在 感染过程中，病毒基因组可在宿主细胞内形成双链DNA形式的中间复制型DNA。提取这种复制 型DNA，用单链核酸酶去除两端的发夹结构，就可对该病毒全基因组进行克隆;也可用适当的内切酶切割后，回收所需的片段进行克隆。 双链DNA病毒的基因克隆 绝大多数的动物致病性DNA病毒含有双链DNA基因组,但是它们之间的差别较大。对于较小的 双链DNA病毒， 如SV40、乙型肝炎病毒等，它们的基因组为环状双链DNA。在克隆时，使用对这些环状DNA只有单一切点的内切酶切割，然后与适当的载体连接，就可以建立全病毒基因组的无性繁殖系。对于较大的双链DNA病毒，如痘病 毒科和疱疹病毒科的成员，克隆它们的全基因组十分困难。必须用适当的内切酶将基因组切成较小的片段，然后再建立各片段的无性繁殖系，即建立基因组文库。或者根据研 究目的，回收其中的目的片段进行目的克隆。但是，这类病毒DNA均为线状双链，在克隆二 个末端片段时，必须对两端的基因片段的末端进行修饰，如补平或加接头，然后再行连接 克隆。 RNA病毒的基因克隆 对分节段的RNA病毒，如流感病毒、呼肠孤病 毒和轮状病毒等基因组，可以先分离特定的RNA片段，反转录cDNA后，与适当的载体质粒， 加G/C尾或A/T尾进行连接。对不分节段的RNA病毒基因组，也要分段反转录成cDNA后，进行 克隆。 病毒基因组中某一特定基因片段的克隆 如果已经了解这一病毒基 因组的酶切图谱，则可选用适当的限制性内切酶切割病毒基因组，回收特定片段，重组到适当的质粒载体，进行克隆；如果知道需要克隆的基因片段的序列，便可设计并化学合成一对 特异引物，用PCR法扩增这一片段，然后重组到适当的质粒载体进行克隆。虽然由于病毒种类和实验目的的不同，基因克隆的方法也不尽相同，但任何一种病毒基因克隆方法均有3 个 主要步骤：1、病毒基因组的提取；2、与质粒载体的连接重组；3、重组质粒的筛选、鉴定 。现分别描述如下： 1、病毒基因组的提取 这是基因克隆的一个重要环节。其基本原则是：先从感染组织或细胞,以及含病毒排泄物和分泌物中提取病毒粒子，然 后 去除病毒蛋白，提取病毒核酸。在提取过程中，要注意避免核酸酶对病毒核酸的降解作用。特别是在提取RNA时，所用的试剂和用品均需要事先进行无RNase处理或高压灭菌。此外在提取较大分子量的病毒DNA时(如痘病毒DNA)，要彻底去除病毒蛋白(通常使用蛋白酶K)和避免 剧烈振荡(否则核酸链断裂)。从纯化的病毒粒子提取病毒核酸的一般方法如下：①取适量纯化的病毒粒子(病毒纯化方法详见第十三章)；②②加入蛋白酶K至终浓度500μg/ml、SDS至终浓度1%，37℃水浴30分钟；③加等体积酚/氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次；④于水相中加1/10体积25mol/L KAC或5mol/L NaCl，再加25倍体积无水乙醇,置-20℃ 至少2小时或-80℃(或液氮气相)15分钟；⑤在4℃下，15 000r/min离心15分钟，小心吸去上清；⑥70%冷乙醇洗涤沉淀，真空抽干，或置37℃干燥，最后根据需要加适量无菌去离子 水或TE缓冲液(10mmol/L Tris•HCl, pH80, 1mmol/L EDTA)溶解核酸沉淀，-20℃保存备 用。 这样提取的核酸纯度较高，如果是DNA，则可直接用于酶切与克隆；如果是RNA，则可直接 进行常规反转录合成cDNA,或者应用反转录PCR扩增所需基因片段（详见本章第五节）。PCR不要求十分纯净的病毒。可直接用聚乙二醇(PEG)浓缩的病 毒提取核酸样品。对不易纯化的病毒进行基因克隆时，可在病毒粒子装配之前，病毒核酸复制达高峰时，直接提取感染细胞的核酸，用PCR方法扩增所需的基因并克隆之。现以猪瘟病 毒感染细胞总RNA的提取方法为例，介绍如下：(1)创造一个无RNA酶(RNase)的环境: RNa se无处不在，很难灭活。RNA在提取过程中极易被其污染而降解，为了能提取到完整的RNA 样品，应创造一个无RNase的环境。为此，必须做到以下几点：①必须采用灭菌的一次性 塑料制品，不得重复使用。我们经验表明这些塑料制品无RNase污染，不需预先进行RNase灭 活处理；②非一次性的玻璃和塑料用品须在使用前适当处理，以确保无RNase。玻璃器皿 应于250℃干烤4hr，塑料器皿应用005%焦碳酸二乙酯(DEPC)浸泡过夜，然后高压灭菌; ③所有溶液(Tris除外)均须加入005%的DEPC，室温处理过夜，然后高压灭菌，去除DEPC； ④整个操作过程应戴一次性手套。(2)感染细胞总RNA的提取:①单层细胞在接种病毒4 8hr后，倾弃培养液，用灭菌的冷PBS(001mol/L，pH74)将细胞单层洗2遍；②按每10 8细胞加8ml变性溶液于感染细胞单层上，轻微摇动，直至细胞裂解脱落。此时，溶液变粘稠。变性溶液的成分为4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠(pH70)，05%十二烷基肌氨 酸钠（Sarkosyl）， 01mmol/L β巯基乙醇;③用吸管将此细胞裂解液转移至50ml锥 形灭菌离心管中; ④加入1/10体积的2 mol/L NaAc(pH40)于上述裂解细胞液中，颠倒并充分混匀；⑤加等量水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(50∶49∶1)混合物，颠倒混合，轻轻振荡10秒，冰浴15分钟； ⑥4℃，8 000r/min离心20分钟；⑦小心吸取含RNA的上层水相至另一新的50ml离心管中; ⑧加等量异丙醇，置-20℃过夜,或液氮气相(或-70℃)15 分钟;⑨4℃，8 000r/min离心15分钟沉淀RNA，倾去上清；10将RNA沉淀重悬于5ml变性溶液中，为加速溶解，可65℃短时加热；11重复⑧、⑨步。12用75%的冷乙醇洗RNA沉淀2遍。13RNA沉淀在真空抽干机中干燥15～20分钟，但不要完全干燥，以免难以溶解；14将RNA溶于1ml无RNase的去离子水中，-20℃贮存。如欲长期保存，可加NaAc(pH5 0)至终浓度02mol/L，而后加25倍体积的无水乙醇，置-70℃贮存。 2、连接重组 即在试管中将病毒DNA(包括cDNA)与适当酶切的质粒载体DN A连接在一起，形成重组质粒，从而构建病毒DNA的无性繁殖系。将病毒基因片段连接到质粒 载体上时，可有以下几种连接方式：①最常用的是粘端连接。若DNA插入片段与适当的 载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同一种内切酶产生 的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端，后者连接成的DNA不能再被原切割内切酶 识别，而不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。同源粘性末端连接效率高，但 也存在弊端，例如插入片段存在两个方向插入的可能性；插入片段间可相互连接，导致载体中可能存在几个插入片段；载体自身环化机率高，故应在连接前，将酶切完全的质粒载体DN A用碱性磷酸酶处理，使其5端去磷酸化以减少自身环化，降低假阳性重组子背景。②如 重组对象不适合粘端连接，则可以用平端连接进行重组。通常的做法是用产生平端的内切酶切割载体。如用产生粘端的内切酶切割载体，其产生的粘端若是5端突出的，需要用DNA 聚合酶将粘端补平；若是3端突出的，需要用单链核酸酶或T4 DNA聚合酶(它有35 外切酶活性)将突出的3端削平。病毒DNA同样也需补平或削平，将其修饰成平端。然后再 用连接酶将它们连接在一起。平端连接的特点是可以恢复一个原始的，甚至产生一个新的酶切位点。位点的恢复或创建是十分有用的，它提供了一条简捷的重组子筛选鉴定途径，并可 方便地使插入片段重新从重组子中回收出来。平端连接存在的弊端是它的连接效率比粘端连接低得多，连接时需要高浓度的连接酶和高浓度的DNA末端(大于1μmol),而且插入方向不确 定。③也可以一端是粘端，另一端是平端进行连接。例如要把 Eco RI/ Hae Ⅲ的目的基因克隆到pBR322上时，首先用 Hin dⅢ切开质粒DNA，用大肠杆菌DNA多聚酶I的Klenow片段，修补 Hin dⅢ消化后的5端突出部分，使之成为平端，再用 Eco RI消化，电泳纯化，所得载体DNA的一端为平端，另一端 为 Eco RI粘端。这样就可以与 Eco RI/ Hae Ⅲ的目的基因进行连接。连接中，外源DNA片段 的插入只有一种可能性，有助于病毒DNA与载体的定向克隆。④将病毒DNA修饰成平端后，可用酶促法在二端加上适当的接头(linker)或适配子(adaptor) ，将其修饰成粘端，然后再与相同粘端的载体连接。这种连接虽然有助于病毒DNA片段的 回收，但是修饰过程复杂，效率也低，转化细菌后非重组背景高，且可能有多拷贝插入及双 向插入等。 3、载体选择与处理 用于分子生物学诊断的病毒基因克隆通 常使用的质粒载体是pBR322及其衍生质粒和pUC系列质粒(pUC18/pUC19)等(见图15-1,图15-2 ),它们均属松弛控制型质粒，在宿主细菌细胞中有很高的拷贝数，在用氯霉素或壮观霉素扩增后拷贝数可超过1 000，因此病毒基因片段插入这类质粒以后，可以大量制备。质粒pBR32 2含有氨苄青霉素(Ampr)和四环素(Tetr)抗性基因，含该质粒的细菌可抵抗这二种抗生 素。该质粒的全序列已被测定，外源DNA片段可克隆到四环素基因中的单一酶切位点 Cla I、 Hin dⅢ、 Ba m HI或 Sal I,从而导致Tetr基因灭活，转化 细菌就只抗Amp而对Tet敏感；外源DNA片段也可克隆到Ampr基因中的单一酶切位点 Pst I或 Pvu I,从而导致Ampr基因灭活，转化细菌就 只抗Tet而对Amp敏感。pUC18/pUC19克隆质粒均含有一个多克隆位点，外源DNA片段可插入多克隆位点中的任何酶切点，可粘端连接，也可平端连接。由于pUC18/pUC19质粒可表达LacZ 见后述)，而外源DNA插入多克隆位点将阻碍β 半乳糖苷酶氨基端片段的表达，从而 破坏了α互补。因此可以用组织化学筛选法挑选重组质粒。pUC18与pUC19的区别仅限于多克 隆位点的方向相反，在其他方面并无不同。上述细菌质粒主要用于较小的病 毒DNA片段(＜10kb)的常规克隆，如果要克隆10kb以上的病毒DNA片段，通常使用粘性质粒和 λ噬菌体载体。克隆成功与否,除与连接方式以及载体选择有关外，载体的处理也是一 个重要环节。为了提高连接效率，处理载体时应注意以下几点： (1)应加入常用量5～10倍的内切酶水解载体，以保证载体被完全酶切；(2)如用双酶切割 载体，则必须电泳回收载体片段，除去双酶切所产生的小DNA片段；(3)如粘端连接,单酶 切处理过的载体必须用碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，防止载体自身环化。C IP可以水解掉DNA5末端的磷酸。对于3末端突出的DNA(如 Pst I水解，需用10倍于5末端突出DNA(如 Eco RI, Hin dⅢ)的CIP进行去磷酸化，以达到最少的载体自身环化。去磷酸方 法如下：①DNA加入10倍去磷酸化缓冲液，5端突出的DNA，每100pmol 5磷酸基团加 入1个单位的CIP，37℃反应30分钟。平末端或3端突出的DNA，每2pmol 5磷酸基团加1个 单位CIP，37℃保温15分钟后，再加CIP，55℃反应45分钟(2μg 5kb的线性DNA约含14pmol 左右的5磷酸基团)；②加入SDS、EDTA(pH80)和蛋白酶K分别至终浓度05%、 5mmol/ L和50μg/ml，混匀后56℃反应30分钟；或加EDTA(pH80)至终浓度为5mmol/L，65℃保 温1小时或75℃，10分钟灭活CIP;③冷却至室温后，加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一 次;④乙醇沉淀，离心，抽干，溶于无菌去离子水，浓度最好为100μg/ml,-20℃保存备 用。 10倍CIP去磷酸化缓冲液： 10 mmol/L ZnCl2 10 mmol/L MgCl2100 mmol/L Tris•HCl,pH80 4、DNA片段的体外连接 DNA片段间的体外连接是DNA克隆的核心步骤，本质上是一个酶促的生物化学过程， 这个酶称为DNA连接酶(DNA ligase)，主要有二种：T4噬菌体DNA连接酶(简称T4 DNA连 接酶)和大肠杆菌DNA连接酶，它们能将两个独立的DNA片段形成磷酸二酯链共价连接,但 以T4 DNA连接酶的应用最为广泛。由于大肠杆菌DNA连接酶对DNA末端要求严格(同源粘端) ，而且几乎不能催化平端DNA分子间的连接，所以不常使用。连接反应中的各种成份及其组成的体系不同程度地影响着连接反应的速率和产物形成。对于平端连接,在T4 RNA连接 酶 存在时，T4 DNA连接酶的连接效率可提高20倍。浓度为15%的PEG8 000可显著提高 平端连接效率1～3个数量级，因此可使连接反应在酶和DNA浓度不高的条件下进行。连接反应中的ATP是T4 DNA连接酶的辅助因子，其浓度 对酶的催化活性影响很大。在ATP浓度为05～5 mmol/L范围内，ATP浓度升高对T4 DNA连 接酶产生可逆性抑制，当ATP高达75mmol/L时，对连接酶的粘/平端连接活性均有抑制作用。所以在连接时，平端连接用较低ATP浓度(05mmol/L),粘端连接一般用05～10mmol/L AT P。连接反应中，DNA末端的浓度、载体与片段的比例将直接影响连接物的产率和分子构型 。如果DNA浓度过低，DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DN A分子的末端的概率。结果造成质粒DNA过多地自身环化(即分子内连接)，有效连接产物明显降低;如果连接反应中DNA浓度有所提高,则在分子内连接发生之前，某一个DNA分子的末端 碰到另一个DNA分子末端的可能性也有所增大，有效连接产物明显增加。不同大小的分子， 其所需DNA的浓度也不一样，一般来说分子越大，连接时所需的DNA浓度越小。就pUC18载 体 而言，有效连接的DNA浓度应为20～60μg/ml。对于一个给定的连接混合物而言，产生有效 重组子的效率不仅受反应中末端的绝对浓度的影响，而且还受载体与外源DNA末端的相对浓 度的影响，如外源DNA末端浓度比载体低得多，有效连接产物的数量将很低，以致最后很难挑选 出带重组子的转化菌落。如外源DNA末端浓度比载体高得多，连接时将导致大量寡聚体分子 的形成,同样影响有效连接。一般来说，在连接反应中外源DNA末端的浓度是载体的2～3倍时 ，有效连接率最高，产生有效重组子的数量最多。连接反应的操作步骤如下：①取100 ～200ng CIP去磷的线性载体DNA，加入2倍摩尔数的外源DNA片段；②加入2μl 10倍T 4 DNA连接酶缓冲液；③加入ATP终浓度05～1mmol/L(平端连接时为05mol/L )；④ 加入灭菌去离子水补足19μl；⑤加入1μl T4 DNA连接酶，酶的活性高时少加，但 平端连接要尽可能多加，不过加酶的最大体积不超过反应总体积的1/10，否则其中的 防冻保护甘油将影响酶的活性。另外，加入1单位T4 RNA连接酶可使平端连接效率增加约2 0倍; ⑥16℃连接4小时，或4℃连接过夜；⑦75℃灭活连接酶，终止反应，取2μl电泳 鉴定是否已经连接；⑧取3～5μl转化感受态菌。 10倍T4 DNA连 接酶缓冲液： 200 mmol/L Tris•HCl pH8050 mmol/L MgCl250 mmol/L DTT500μ g/ml BSA组分Ⅴ(也可不用) 对于具体的连接体系，包括反应体积、时间、温度、DNA浓度及酶的用量等都可根据实际情况作相应的调整，但反应体积一般不超过50μl， 温度不超过25℃，时间为2～16小时。 5、转化大肠杆菌 体外连接的重组 子，只有导入适宜的大肠杆菌受体后，才能随着大肠杆菌的增殖而大量复制和扩增，从中提取大量的克隆基因。质粒DNA或以其它载体构建的重组子导入细菌的过程，称为转化。转 化时，受体细菌必须经过特殊处理，诱导细菌产生一种短暂的“感受态”，这样才能摄入各种不同来源的DNA。这种处理过的受体细菌，即为“感受态菌”。感受态菌的制备及转化方 法如下：①将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16～20小时;②从平板中取出1个2～3mm大小的单菌落，移至含100ml LB 培养基的500ml三角瓶中，37℃ 300r/min 强烈振荡培养3小时，使细菌的OD600达02～04;③将培养物置冰浴10分钟，然后转移到离心管中，4 000r/min,4℃离心20分钟;④弃上清，倒尽剩余液体，加入10ml 冰预冷的01mol/L CaCl2,置冰浴10分钟;⑤4 000r/min，4℃离心20分钟，弃上清，每100ml的原培养物再加入4ml预冷的01 mol/L CaCl2溶液，悬浮细菌;⑥按每份200 μl分装细菌，若不马上进行转化，该感受态菌可以加入终浓度为10%的灭菌甘油，置-70 ℃冻存;⑦加10μl含40ng的质粒DNA溶液至200μl感受态菌中，混匀后，置冰浴30～60 分钟。同时设立两个对照组：取10ng(10μl)已知的超螺旋质粒DNA加至感受态菌中，作阳 性对照；不加任何DNA的感受态菌作阴性对照;⑧42℃热冲击90秒钟，迅速放回冰 浴冷却1～2分钟后，加入800μl LB培养基，37℃静置培养60分钟;⑨取200μl转化菌液铺于90mm直径的LB琼脂平板上(琼脂中含有适当浓度的抗生素)，室温下放置20～30分钟，待溶液被琼脂吸收后，倒置平皿，于37℃培养12～16小时后即可观察到抗性菌落。用氯化钙 制备的感受态菌可使每μG超螺旋质粒DNA产生5×106～2×107个转化菌落，这样的 转 化率足以满足所有在质粒中进行病毒基因常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，重复性很好。制备的感受态菌可保存于-70℃或液氮气相，但保存时间过长会使 转化效率受到一定影响。除上述自制感受态菌外，也可以从商业途径购买制备好的冻存的各种感受态菌，这些产品非常可靠，一般每μG超螺旋质粒DNA可产生108以上转化菌落。 电穿孔法是另一个有效的转化细菌途径，适用于各种细菌，转化率比化学法制备的感受态菌高10～20倍，可达109～1010落菌／μg质粒DNA。其原理是以高电压(数千伏 )在很短时间(微秒时间)内脉冲电击细菌细胞，使细胞膜产生许多小孔，质粒DNA通过这些小 孔进入菌体而转化。针对不同的菌株，需要优化各种参数，包括电场强度、脉冲长度、脉冲 次数、电极与样品的距离以及细菌和DNA浓度等。更高的电压、更长的脉冲时间虽然能提 高转化率，但细菌的存活率降低。电穿孔法操作简单，制备用于电穿孔的细菌比制备感受态菌容易。细菌生长到对数中期后加以冷却，离心，然后用低盐缓冲液充分清洗以降低细菌悬 液的离子强度,但不必形成原生质体。然后用10%甘油重悬细菌，使其浓度为3×10 10细菌／ml，在干冰上速冻后置－７０℃贮存。这样，每小份细菌融解后即可用于转化， 其有效期至少为6个月。电穿孔在低温下(0～4℃)进行，如果在室温下操作，转化效率可能 会降低百倍。电穿孔法需要一台特殊的精密仪器——电转移仪，它能很好地选择和控制各种参数，以求最佳效果，许多厂商都生产这种仪器，但因价格昂贵，限制了此方法的广 泛应用。 6.重组子的筛选与鉴定 基因克隆过程中，DNA的连接往往不够 理想：载体DNA即使已用CIP处理，由于反应不完全，常常发生自身环化；载体的酶切可能不 完全，以及出现好几种连接情况等等。在建立病毒基因文库时，载体与不同DNA片段连接后 ，也 形成不同的重组子。故在转化以后，从转化细菌菌落中挑选试验者所设计和期望的重组子是 病毒基因克隆中最后一道重要工序。挑选后，通过细菌培养以扩增所需重组子，回收所需基因片段的大量拷贝，以便进一步研究该基因的结构、功能或表达该基因产物。虽然不同 的克隆载体及相应的宿主系统，其重组子的筛选、鉴定方法不尽相同，但均采用以下几种基本方法：(1)快速法提取质粒鉴定大小: 用牙签从平板上直接挑取菌落，加入50μl裂 解缓冲液(50mmol/L NaOH,5mmol/L EDTA,05%SDS,10%甘油，002%溴酚兰)立即振荡打散 细菌，去掉牙签，取30μl于08%琼脂糖凝胶电泳，同时电泳载体质粒对照，EB染色后，紫 外灯下观察是否有比载体质粒大的重组子带，根据编号从平板上挑取相应菌落，培养3~5ml 菌液，提取重组子DNA进行酶切分析。本法快速、简单。一次可处理约40个菌落，一天可鉴 定约200个菌落，可作重组子的最初筛选。(2)β 半乳糖苷酶筛选系统(α互补): 现在使用的许多载体,如pUC系列、M13 噬菌体载体和pGEM系列等都带有一个大肠杆菌DNA片段，其中含有β半乳糖苷酶基因(la cZ)的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，这个编码序列中插入了一个多克隆位点，它 并不破坏读码框架。这种载体适用于可编码β半乳糖苷酶C端部分的宿主细胞。虽然宿主 和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白质。这 样，lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β半乳糖 苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种现象叫α互补。由α互补而产生的Lac+细菌易于识 别，因为它们在生色底物5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷(Xgal)存在下形成蓝色菌落。然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无α互补能 力的氨基端片段。因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。这一简单的颜色试验大大简化了在这种质粒载体中鉴定重组子的工作。仅仅通过目测就可以轻而易举地从数千个菌落中挑选 出可能带有重组质粒的菌落。但是并非所有白色菌落均带有重组质粒，所以最后必须通过小量制备质粒DNA进行限制性酶切分析，才能确定带有重组质粒的菌落。操作步骤如下：① 在一事先制备好的含相应抗生素的LB琼脂平板上加40μl Xgal(以20mg/ml的浓度溶于二甲 基甲酰胺中)和4μL异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)溶液(浓度为200mg/ml)，均匀地涂 布整个琼脂表面，置37℃使表面液体挥发；②将转化菌液100~200μl涂布于上述平板表面 ，液体吸干后，于37℃倒置培养过夜(12~16小时)；③将平板放置4℃数小时，使蓝色充分 显现，然后观察。带有重组子的细菌将形成白色菌落(无α互补)，可将其挑出，小量制备质 粒DNA,进行酶切分析。带有载体质粒的细菌，将仍形成蓝色菌落(α互补)。(3)插入灭活筛选: 这种方法只能用于比较老的载体，这些载体带有两个或更多个抗生素抗性基因和 分布适宜的限制性酶切位点。如前所述的pBR322载体，它含有四环素(Tetr)和氨苄青霉素 (Ampr)二个抗性基因。以外源片段插入灭活Tetr基因为例。连接物转化细菌后涂布含 Amp的平板，长出的菌落一些含重组子，另一些则含有在连接中自身环化的质粒DNA，为区别两种转化体，可以用分别含有氨苄青霉素和四环素的两种平板，在互相对应的位置上，各自 接入同一菌落，照此将一批菌落接种于平板的各处。在四环素平板中存活并生长的菌落含有带活性的Tetr基因的质粒，这样的质粒不可能有外源DNA插入。在四环素平皿中不生长而 在氨苄青霉素平板中生长的菌落含有带灭活的Tetr基因的质粒，这些质粒可能带有外源DN A序列，最后小量提取这些质粒DNA进行酶切鉴定。(4)菌落原位杂交筛选:以放射性或 非放射性方法标记需要克隆的病毒DNA片段，以此作为基因探针，对连接物转化的菌落进行原位杂交，也是鉴定含有重组子的菌落的常用技术。这种方法很容易同时筛选数十万个细菌 菌落，从中找出带有试验者所需要的重组子的菌落，是从基因文库中挑选目的重组子的首选方法。现以从少量菌落中挑选出目的重组子为例：①在含有适当抗生素的琼脂板上，铺 一张略小于平板直径的硝酸纤维素滤膜，使滤膜均匀湿润,避免产生气泡,。操作时需戴手套 ，防止手指直接接触滤膜；②用牙签将欲筛选的单个细菌菌落转移(划线或涂点)至滤膜上 ，同时相应地转移到另一贮存琼脂平板上。每个菌落在两个平板上的位置应该相同。并做好标记，以便杂交后寻找阳性菌落。最后在滤膜上特定位置接种一个非重组质粒菌落作为阴性 对照；③倒置平板,37℃培养,使菌落长至05～10mm直径;④取3只直径比滤膜大的平 皿(如有多张硝酸纤维素滤膜，可改用方盘等容器)，分别放入二张直径稍小的园形滤纸；⑤分别加入A：05mol/L NaOH, 15 m ol/L NaCl; B:15mol/L NaCl, 05mol/L Tris•HCl(pH74);C:2倍SSC，湿透滤纸，倒 掉多 余液体(滤纸过湿，菌落在裂解过程中会胀大并扩散，从而影响杂交信号);⑥用平头镊取 出长有菌落的滤膜，菌落面朝上依次放于A、B、C三种液体湿润的滤纸上，各放5分钟;⑦ 将处理好的滤膜放于一张干燥的滤纸上,室温干燥30～60分钟后,将滤膜夹在两张干滤纸之间 ,再用二块玻璃板夹好,放80℃干烤2小时,固定滤膜上的DNA;⑧进行杂交检测,方法见核酸 杂交技术。最后再小量提取原位杂交阳性菌落中的重组子,用酶切分析鉴定重组子的正确性。 20倍SSC: 3mol／L NaCl,03mol／L柠檬酸钠,pH76。(5)小量提取质粒DNA进行酶切分析:由于体外DNA重组是按设计进行的,所以在用上述方 法初步鉴定重组子以后,可以小量提取质粒,按设计要求,用酶切分析方法对重组子的正确性 加以验证。①用牙签挑取重组子菌落于3ml含适当抗生素的LB培养液中,37℃振荡培养过 夜;②取出15ml菌液于小离心管中,12 000r/min离心1分钟;③完全吸干上清;④将细菌沉淀完全分散于100μl冰预冷的灭菌悬浮液中(50mmol／L葡萄糖,25mmol／L Tris•HCl pH80,10mmol／L EDTA pH80);⑤加入200μl新配制的裂解液(02mol／L NaOH,1％ SDS)迅速颠倒混匀(不要振荡),冰浴5分钟;⑥加150μl预冷的5mol／L乙酸钾,冰浴中和1 0分钟;⑦15 000r/min离心5分钟,将上清移置另一离心管;⑧酚／仿抽提,乙醇沉淀,离 心,干燥,DNA沉淀溶于20μl灭菌水;⑨取少量质粒DNA,用适当酶切割后电泳,分析 结果。
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