临床常用电镜技术（二）

录入时间:2009-6-25 17:19:10 来源：青岛海博

5. 悬浮样品的免疫金标记

　悬浮样品的免疫金标记法，容易产生非特异性反应，这主要是抗原、抗体以及胶体金抗体比例不合适的缘故。作者在实验中发现，应用高速离心法除去过量的抗原或抗体或胶体金抗体，不仅有助于除去非特异性反应，而且不会降低敏感性。其具体操作步骤：①取抗原(病毒液)50μl和相应的抗体(高免血清)50μl混合均匀；②置于37℃温箱中作用1小时，加蒸馏水至满管，以10000r/min速率离心30分钟，弃上清；③将沉淀物用蒸馏水100μl悬浮；④加50μl葡萄球菌A蛋白或第二抗体包被的胶体金溶液，混合均匀；⑤置于37℃温箱中作用30分钟；⑥加蒸馏水至满管并以同样速率和时间离心；⑦弃上清，取其沉淀物，用100μl蒸馏水将其悬浮，负染后电镜观察(图12-23)。[HT5”SS] 图12-23　免疫金标记的电镜图像(比例尺为100nm)　猪轮状病毒粒子(箭头) ——自李成等

6. 快速包埋超薄切片

一般包埋方法需时较长，大致需2～3天，甚至长达1周左右，郝桂玉等建立了适于口岸动物检疫和临床快速诊断病毒病的快速包埋方法：①固定，4％戊二醛固定10分钟，?1/15mol/L?磷酸盐缓冲液(PBS)pH7?4冲洗数次，1％四氧化锇固定10分钟，PBS冲洗一次；②脱水，70％、95％、100％丙酮各5分钟，内含无水硫酸钠的100％丙酮换2次；③浸透，1份100％丙酮加1份包埋剂(Epon8127?0g、DDSA1?5g、MNA4?5g、DMP?30按全量的2％加入)，在37℃温箱中浸透10分钟，纯包埋剂混合物浸透10分钟；④聚合包埋，用牙签将样品挑入胶囊或模具中，然后灌注适量包埋剂，置于95℃烤箱中，经1小时聚合，待冷却后切片，2％醋酸铀水溶液染色2分钟，枸椽酸铅染色5分钟，即可电镜观察。

7. 微波辐射制样

微波辐射制样方法是将生物样品的固定、脱水、浸透、包埋、染色等操作均在微波炉中进行,予以一定“火力”和时间的微波辐射，从而加速制样过程。　　(1)微波辐射制样技术的原理:　　微波是一种非电离辐射的电磁波，其波长在1mm至1m之间，用频率为2450MHz(兆赫兹)。生物样品中的一些双极分子，如H?2O、有极性侧键的蛋白分子以及电荷不均一的其它任何分子，一旦暴露于电磁波的照射下，这些分子以180度的角度以每秒2450MHz的高速进行转动与震动，在短时间内组织内部便产生高热，从而加速固定、包埋、染色，以及免疫反应、组化反应等的时间和提高制备质量，利用家用微波炉即可在两小时内制备出高质量的包埋样品供电镜观察。图片的反差良好，精细度极高，染色沉淀很少。对包埋后的样品进行免疫金标记，亦可大大加速反应。通常利用在微波炉四周加水的方法来调节微波炉内的温度，以免炉温度过高破坏组织内的抗原性。　　(2)微波辐射快速制样技术的基本程序：现以国产蚬华牌家用微波炉为例来介绍。该仪器的功率为550W，并设有P1～P10共10个火力段。　　①取材取新鲜材料，按超薄切片常规法进行；　　②固定将样品置于2?5％戊二醛中，放入微波炉，在P1火力段下辐射15秒钟作前固定，用磷酸缓冲液冲洗样品3次，再用1％锇酸液浸泡并放入微波炉中，于P1火力段下经15秒钟作后固定；　　③脱水在室温下放置60秒钟，经磷酸缓冲液冲洗3次(每次3分钟)，用50～100％系列丙酮逐级脱水，每级脱水均在P1火力段下辐射1分钟左右；　　④浸透先将样品放入环氧丙烷中，在室温下放置10分钟，然后依次投入环氧丙烷与环氧树脂1∶1和1∶2混合液中，在P1火力段下2分钟；然后将样品放入纯环氧树脂中，在P1火力段下3分钟；　　⑤包埋将样品置于配制好的包埋液中，并于周边放一盛有300ml水的烧杯，在P1火力段下30分钟，而后再移去周边的烧杯，继续在P1火力段下辐射30分钟；　　⑥切片与常规超薄切片法相同；　　⑦染色铀染色动植物组织切片最佳辐射时间均为30秒；铅染色动物组织切片最佳辐射时间为30秒,而植物组织切片为20秒,染色液经微波辐射后的温度应控制在20～40℃。　　(3)微波辐射制样注意事项：　　①严格控制辐射温度微波辐射时固定液的温度应控制在40～50℃之间为宜，否则易引起微波损伤，脱水时的温度宜在20℃左右。为了掌握微波炉各功率段下各种溶液的不同温度，最好在实验前预先测定；　　②严格掌握辐射功率制样过程中每一步骤所使用的功率(火力段)不尽相同，但总的说应以小功率辐射为主，而且在需要长时间辐射时(如脱水、聚合和包埋)，最好采用低功率、间断辐射的方式，这样才能保存组织的超微结构；③在每步微波辐射之后，最好让样品在药液中停留一段时间，以保证药液渗入样品并与组织充分结合；　　④微波炉的厂家及型号不同，其功率大小和火力段的功率分配亦不相同，故实验时应根据选用的微波炉来确定每一步骤用的火力段与辐射时间。　　　　　　　　　

8. 免疫快速包埋超薄切片

　某些情况下，单纯用超薄切片法不能达到检测病毒及抗原的目的，必须运用免疫标记方法才能达到目的。因此，将免疫标记与快速包埋超薄切片相结合，建立了免疫快速包埋超薄切片法。此法比常规超薄切片法快得多。免疫酶标记和免疫胶体金标记均可使用快速包埋或微波辐射包埋法,以提高鉴定病毒(抗原)的速度和准确性，更有利于临床应用。

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