生物大分子主要包括蛋白质、核酸、多糖和脂类。这些物质在生命活动中起着重要作用，所以研究它们的大小、形态、空间结构以及各种存在形式，对了解其功能和在整个生命过程中的变化都具有重要意义。通常研究生命大分子多用两种方法：一是用物理和化学方法测定其理化特性；二是用电镜和X射线衍射技术观察分析其形态及空间结构。X射线衍射技术在蛋白质结构研究方面虽然分辨率高达01nm，但只适用于能形成结晶体的样品，局限性较大。而电镜观察的方法则比较简便，结果直观可靠。双链核酸分子01nm长度的平均质量为196左右，如果DNA的分子量为2×106Da，则其分子长度可达1002nm，即1μm左右。由此看来，应用电镜技术观察和研究生物大分子结构不论其分辨率还是放大倍数完全可以达到目的和要求，当然这与样品制备有着密切关系。目前，应用电镜技术研究最多的是蛋白质和核酸两大类，其制样方法如下。 1.蛋白质分子的电镜样品制备 由于蛋白质样品的电子散射能力很低，极易聚合成堆，所以制样时必须设法增强其反差和进行分散处理。蛋白质分子从形态上可大致分为纤维状和球状两大类。纤维状蛋白是由沿一个单轴平行排列的多肽链所组成，形成长纤维或薄片，其性质强韧、不溶于水，如动物的胶原、角蛋白、弹性蛋白等；球状蛋白的多肽链呈盘曲折叠，许多较大的蛋白质都有二条或多条肽链，形成复杂的三级、四级结构。球状蛋白多数溶于水，能结晶，如酶类、血红蛋白、抗体等。还有些蛋白质则与其它组分结合成复合体，如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白(病毒)等。根据不同蛋白质和不同的研究目的，所用的制备方法也不同，其制样方法有负染、拟复型、金属投影和超薄切片法等。 (1)负染色法：负染色是制备蛋白质电镜样品最常用的方法，既适于游离状态的单个分子，又适于蛋白质结晶体。其制样过程与常规负染法相同，但应注意以下几点：①采用低噪音的碳膜，因为蛋白质分子通常都很小，利用常规的有机膜在负染后会出现一些假象结构，容易造成误判，因此最好采用低噪音的纯碳膜，碳膜厚度以10～15nm为宜。②分离蛋白质的溶液应有适当的浓度、离子强度和pH值，其浓度以5～10μg/ml为宜。如果浓度太低，观察时难以寻找。浓度太高又易堆集，难以看清单个分子的结构。所用缓冲液浓度一般不超过2mmol/L，高浓度的盐离子会在铜网膜上形成结晶，影响电镜观察。③负染色剂应选用具有较大惰性的、不会引起蛋白质结构产生变化的试剂。常用的有磷钨酸、钼酸铵、硅钨酸等。醋酸铀也可用，但pH值大于6时就会发生沉淀④负染色操作，常用悬滴法或喷雾法。滴附后，载网需用双蒸水进行多次醮洗，洗去样品中的盐类及杂质，然后再进行负染色。使用碳膜时，因为蛋白质样品不能均匀地吸附，必须先将碳膜用辉光放电装置或静电荷发生器或直接放在离子溅射仪中处理，使碳膜表面带上一定量的静电荷。有时将染液和样品混合后再粘样，往往也能使蛋白质样品较好地分散在支持膜上。应用喷雾方法时，将蛋白质样品和染液先混合，为了避免混合后蛋白质溶液发生沉淀，要求染液的pH值不能接近蛋白质的等电点。 (2)云母拟复型法：利用喷雾法及新鲜剥开的云母片表面的强亲水性，可以解决蛋白质分子分散难的问题。但该法通常只能观察分子的外形及大小，难以看到内部结构，分辨率也较低，但对一些纤维状蛋白质分子还是很有用的。具体制样方法见本章的“金属投影和复型”节。 (3)金属投影法： 金属投影法不仅能增强蛋白质晶体的反差，而且能增加样品表面的导电性，以便用电子衍射技术对晶体进行分析研究。具体制样方法按常规法进行。 (4)超薄切片法：超薄切片法用于研究蛋白质晶体样品。对于一些体积较大，而且晶形较完整的结晶体，可以根据结晶学的规则来选择特定的方向进行切片，以便得到有关的结晶学参数。制样按常规法进行。如果结晶体很小，切片不易定向，也可通过分析许多随机定向的切片之间的内在关系，来判定晶体的方向，推算出结晶学参数。例如，昆虫多角体病毒的包涵体是一种蛋白质结晶体，通过超薄切片能了解它的晶格形式、取向和间距等资料。 电镜观察的要求：①电镜要有较高的分辨率，观察蛋白质分子样品，需要把电镜调至最佳状态，精确合轴和消像散，准确调焦，消除样品飘移等因素；②要尽可能减少辐射损伤，因为蛋白质分子对电子束较敏感，长时间的电子束照射，对样品会产生损伤和污染，掩盖微细结构。为此可采用如下措施：a.用“冷境”来冷却样品，并使用较小的束电流；b.选择视野要迅速。调焦时，先对准近旁区域，调焦后再将需要的部位移到中央进行照像；c.现代高性能电镜上有最低辐射装置(MDS)，以减小调焦时带来的辐射损伤；d.还有的使用低温样品台、低束流，配合图像增强器，将扫描透射电镜(STEM)运用于大分子的观察等。 2.核酸分子的电镜样品制备根据核酸的结构和功能可分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA大都是长链状的双螺旋分子(有部分病毒如细小病毒为单链DNA)，直径为2nm。通常双螺旋分子再进一步盘绕折叠形成三级或四级结构；RNA大都是单链分子(呼肠孤病毒及双链RNA病毒为双链RNA)通过分子内碱基配对，形成“三叶草”状的二级或三级结构。应用电镜技术不仅可以观察核酸分子的形状和长短，还可以区分是双链还是单链，计算出分子量；通过一些特殊方法，还能分析异源双链分子、杂交分子、转录复合体、核蛋白复合体等(如图12-17)。从而为研究核酸的复制、转录，了解基因组的结构、基因片段的缺失、插入或倒置、基因定位以及碱基组成特征等，提供重要资料。 用电子显微镜直接观察核酸大分子，制样技术上的关键问题是如何克服反差弱和保持核酸分子在溶液中的构型。长期以来主要采用蛋白质单分子层技术，其中以Kleinschmidt方法应用较广。此法利用球状碱性蛋白在水溶液(或盐溶液)表面形成不溶的变性薄膜。当蛋白溶液中含有核酸分子时(上相液)，带有负离子的核酸分子被带正离子的蛋白质分子所包围，蛋白质在水溶液或盐溶液(下相液)表面展开成膜状单分子层时，核酸分子也同时伸展成细丝状的形态。 图12-17 克隆的牛乳多空病毒核酸(横杠=25nm)P表示质粒区域，V表示病毒核酸区域，小箭头指示处为单链区域，大箭头指示处为异源双链分子 ——自Campo等 (1)细胞包素C法：细胞色素C是最常用于这一目的的蛋白质，以斜面法或微量法使其展开成单分子膜。 上相液 4mmol/LEDTA(pH75)125μl；24mol/LNH4Ac125μl。二者混匀后，加入25μlDNA溶液(DNA终浓度为05～10μg/ml)。混匀后，取出5μl，后加入5μl细胞色素C(1mg/ml)。 下相液 005mol/LNH4Ac。 ①斜面法 以直径为10～15cm的干净平皿或塑料盘，充满下相液后，将干净载玻片以30度角斜放在平皿中，溶液表面洒少量滑石粉，以观察样品展开的区域。用微量注射器吸取上相液10～15μl沿玻片斜面滴入，上相液便沿玻璃斜面流下，推开滑石粉在下相液上展开成蛋白质单分子层。约经30秒钟后，以覆膜的载网捞取样品，然后以不同浓度的乙醇(25％、70％、99％)脱水或自然干燥。一般用铂铱合金在7度角以20～30r/min旋转喷镀后，电镜观察。如果先用醋酸铀酒精溶液(浓度为10-3～10-5 mol/L)染色30秒后再喷镀，效果更好。 ②微量法 将下相液4～5滴滴在聚四氟乙烯板上，然后用微量注射器在液滴表面轻轻加上相液5μl，靠液滴的表面张力将样品展开在水滴表面，经2～3分钟后，用覆膜载网捞膜，用不同浓度的乙醇(25％、70％、99％)脱水或自然干燥。一般用铂铱合金在7度角旋转喷镀后电镜观察。 溶液中的核酸分子随溶剂、温度与pH的不同，其所呈现的分子形态也有差异。在核酸结构中的各种化学键,受以上条件改变时影响最大的是各碱基之间相连的氢键。一般DNA总是以规则的双螺旋结构形式存在。两链中的碱基皆按AT与GC的关系配对。它们各自之间皆以氢键相连。因此DNA分子有一定的刚性，用上述方法制备DNA样品容易获得原有的结构图象。 (2)甲酰胺法：由于RNA是单链分子，单链内的碱基常可相互形成氢键而使分子聚集，在电镜下成团出现，无法分清其真实的构型及变化。Davis(1971)在溶液中加入一定量的甲酰胺，解开氢键，使RNA分子或DNA分子展开成链的形态。展开方法也是斜面法和微量法(如上所述)。 上相液 40％甲酰胺中含05～10μg/mlDNA，005μg/ml细胞色素C，01mol/LTris，10mmol/LEDTA，pH85。配好后1小时内使用。 下相液 30％甲酰胺中含10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH85。用前现配。 (3)甲胺盐法：在用电镜研究核酸与蛋白质的相互作用时，为了排除细胞色素C这一类蛋白质在观察时产生的干扰，可用季铵盐中的溴代十六浣基三甲胺(C16H33N＋Br-)或溴代十八烷基三甲胺(C18H37N＋Br-)代替细胞色素C，使核酸分子展开。甲胺盐类的价格只是细胞色素C的1％左右。 上相液 核酸分子浓度为1μg/ml，溴代十六(或十八)烷基三甲胺浓度为005mg/ml，甲酰胺浓度为492％，用02mol/LTris和29mmol/LEDTA作缓冲液调pH至85。下相液 无离子水。 用直径90mm的涂蜡玻璃平皿，倒入下相液后撒上少量滑石粉，用洗净的载玻片以20度左右的倾斜角放在平皿上，用微量注射器吸4μl上相液滴在载玻片上，流至水面上即展开成单分子膜，吸附在覆膜载网上，经脱水或自然干燥后，用铂铱合金旋转喷镀。
上一篇：生物大分子电镜样品的制备
下一篇：临床电镜快速检测病毒技术
