电镜放射自显影(electronmicroscopicradioautography)技术是电镜技术与放射性自显影技术相结合的一种新技术。它把静态的形态学和动态的生理功能的研究有机地结合起来。其原理是在含有放射性物质的组织切片上，敷上一层感光核乳胶，经过一段时间后，从组织切片中放射出来的放射线使核乳胶中的溴化银感光形成潜影，再经过显影处理，使在组织切片中的放射性物质以银粒的形式出现，通过肉眼、光镜及电镜观察，研究该放射性物质在组织切片中的分布及其数量等。该法已成为现代生命科学研究中的重要方法之一，并已得出一些非常有价值的资料，如生物大分子核酸、蛋白质的合成和代谢研究，多糖类和脂肪的合成和转移定位，分子杂交结果的鉴定，酶分子定位，标记抗体对抗原的定位，激素和药物的合成部位，病毒感染细胞中病毒复制过程的定位，宿主细胞中病毒基因的示踪以及感染和未感染细胞新陈代谢的比较等等。 电镜放射自显影的样品制备程序： 放射性同位素标记[BH] ↓ 固定、包埋 ↓ 超薄切片 ↓ [] 铀、铅电子染色[][]喷碳膜(喷镀仪内) ↓[][] ↓ 喷碳膜(喷镀仪内)[][]敷乳胶膜(暗室内) ↓[][]↓ 敷乳胶膜(暗室内)[][]曝光(暗盒内4℃) ↓ [][] ↓ 曝光(暗盒内4℃) [][]显影、定影(暗室内) ↓[][] ↓ 显影、定影(暗室内)[] []铀、铅电子染色 [] [] ↓ 电镜观察 1.放射性同位素的标记 (1)放射性同位素的选择：要考虑放射强度、半衰期以及使用剂量和曝光时间等因素。就β射线而言，能量低者比高者的感光效率高，分辨率也高，因此，如果其它条件相同，应尽量选用能量低的同位素。从感光效果、自显影效率或分辨率考虑，选择的顺序是3H→14C→131I→32P。目前市售的大多数标记化合物都用3H来标记，它已成为该技术中最常用的同位素。 (2)放射性同位素标记化合物：包括研究DNA的有3H胸腺嘧啶核苷、3H放线菌素D；研究DNA的有3H尿嘧啶核苷；研究蛋白质的有脯氨酸、精氨酸、亮氨酸以及氚标记的氨基酸等。放射性标记化合物虽可贮存，但它会产生辐射自分解。如要贮存，最好稀释至所需的放射强度和浓度，以减少自分解。而且须贮存在黑暗处，尤其对不稳定的化合物，要在-140℃下贮放。一般的可在2～4℃冰箱内存放几个星期不变质。如需较长期贮存，最好放在-100℃条件下，并须加1～3％乙醇作稳定剂和抑菌剂。 (3)使用剂量与曝光时间：对于超薄切片，要获得满意的结果必须有足够的剂量。与光镜的自显术相比，剂量要大得多，电镜放射自显影为37×105～37×107Bq/g(10～100μCi/g)体重，细胞培养液中的放射性同位素的含量为37×103～37×107Bq/g(01～100μCi/ml}。为了缩短曝光时间，可加大投与量5～10倍。投与量与曝光时间成反比。 (4)标记方法：常用的有：①注射法，按所需的剂量在一定部位注入体内，完毕后防止外流，可用2％火棉胶封口；②灌胃法，即向胃中引入标记物质；③浇灌饲喂法，用标记物质处理土壤，让植物吸收，再用该植物饲喂动物；④涂抹法，将标记物质涂抹在动物体表，令其通过皮肤进入体内；⑤培养法，向组织细胞培养液中加入一定比强度的放射性同位素，混匀，在37℃下培养，培养时间随材料而定。培养后用生理盐水洗涤，低速离心(1000r/min)5～10分钟，弃上清，初步洗去多余的放射性物质。加生理盐水重新悬浮，再离心，弃上清，将其沉淀块修成不超过05mm为宜。 2.超薄切片 标记后的样品，按常规法制备超薄切片。通常是按一定时间间隔陆续地取样固定，以追踪放射性同位素的转运、代谢等变化过程。 3.乳胶膜的制备 用于电镜放射自显影的核乳胶的直径，理论上是越小越好，以提高分辨率。但当溴化银颗粒的直径小于50nm时,其感光度显著下降，所以通常使用的核乳胶的直径在200nm以下。目前常用的国产乳胶有HW3、HW4；进口的有英国的HfordL4和日本的樱花NRH2等。 核乳胶在常温下为半固体，使用前在暗室红灯下先将其融化稀释。按1∶1、1∶2、1∶4或1∶6加入双蒸水，置热水浴中加热到40℃，约15分钟，充分混匀。核乳胶的浓度越大，制备的乳胶膜上的银粒就越密。稀释后的乳胶用带膜的载网沾一下，待干，用电镜检查银粒是否重叠和留有空隙。合格后置于4℃冰箱中保存。最好是现用现配，否则本底增高，影响成像效果。制备单层乳胶膜常用方法： (1)套圈法: 用有机玻璃或金属做一个与载网直径相当的柱子。带有切片的载网(切片朝上)置于柱子顶端。再用金或银或镍丝等做一个4mm直径金属环，烧结在玻棒上。将金属环浸入乳胶中，垂直插入，轻轻提起，环内即形成一乳胶膜。再将膜轻轻地套在置于柱顶端带切片的载网上。用镊子把载网轻轻夹起，待干后置于暗盒中自显影。 (2)浸涂法: 取一载玻片，充分洗净晾干后，将一小块双面胶纸贴在载玻片的三分之一处，把带有切片的载网放在胶纸上，切片面朝上，每张载玻片上可放2～4个载网。将载玻片慢慢浸入稀释好的乳胶中，徐徐提起。用滤纸抹去载玻片背面的乳胶，垂直地置于无尘处，待干后放入暗盒中曝光。 4.曝光 切片中的射线与乳胶中的溴化银粒子相互作用的过程称为曝光或自显影。通常在暗盒中进行，盒内相对湿度控制在45～50％。密封后置于4℃冰箱中。一般需几周到几个月。准确估计曝光的时间不太容易，通常每隔一定时间(约二周)取样作显影试验，直到效果满意时，就全部结束曝光。 5.显影和定影 通过曝光后得到的结果只能是潜影，必须经过显影和定影后才能观察。显影剂最好使用微粒显影剂，以获得较高的分辨率。常用的有D19或D19b，显影温度为15～20℃，显影时间为2～4分钟。值得注意的是，因显影剂对已形成潜影的银粒和未形成潜影的溴化银晶体都能发生作用，使其显影，只是前者速度快，后者速度慢。正确的显影时间是前者刚好显影清晰，后者还未显影。如显影时间不足，潜影不能充分显示，时间太长，会形成雾点和人为的假象。定影是将未形成潜影的溴化银晶体溶去，留下还原的银颗粒。常用的定影液是柯达F5。 6.电子染色 为了增加自显影样品的反差也要进行电子染色。其方法与常规超薄切片相同，也是用铀和铅染色。电子染色这一步既可放在敷加乳胶之前“先染”，也可在显、定影之后“后染”。先染的优点在于切片上没敷乳胶层，所以在染色过程中不担心引起银粒移位和丢失。缺点是可能在染色中损失一些放射性物质。为了防止染液中的某些基团与乳胶发生作用，在染色后都需喷镀一层碳膜后再敷加乳胶。后染的优点是能较好地保留切片中的放射性物质，缺点是容易产生染色沉淀物。 为了防止样品中的四氧化锇与乳胶颗粒作用导致潜影消退，通常在乳胶层与切片之间喷镀一层碳膜。
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