药敏试验方法

药敏试验方法：
K-B法：
1 从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5麦氏单位。
2 在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。
3 用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动60度，每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。
4 将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。每个纸片中心间距24mm。纸片一旦与平板接触，不应再移动。
5 贴完纸片后，应在15分钟内放入35度孵箱。嗜血杆菌属，链球菌属放入3%-5%的CO2烛缸。
6 孵育24小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与NCCLS手册比较，作出结果判断。 
说明：细菌药敏结果的判断以NCCLS为标准，所以药敏试验的每一步都应严格按照NCCLS操作，否则将失去意义。链球菌、奈瑟菌属、流感嗜血杆菌、除铜绿假单孢菌和不动杆菌外的假单孢菌属不用K-B法.            
肺炎链球菌胶乳凝集测定法
1 在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。
2 从冰箱取出鉴定试剂(Slidex pneumo-kit)于室温。
3 在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。
4 轻轻晃动玻片2分钟，观察结果。
5 2分钟内，如R1出现凝集为阳性；如R1和R2均未出现凝集为阴性。
注：R3为阳性对照。
药敏纸片的选择
1、革兰阴性杆菌（肠杆菌科）
头孢噻肟（CTX）头孢唑林（CZ）头孢他定（CAZ）
氨苄西林（AM） 哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN）
头孢噻吩（CF）环丙沙星（CIP）头孢呋辛（CXM）
庆大霉素（GM）头孢噻肟/棒酸（CTX/CA）
头孢他定/克拉维酸（CAZ/CA）羧苄青霉素（CB）
奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）
亚安培南 头孢匹肟（FEP） 头孢克罗（CEC）
2、铜绿假单孢菌/不动杆菌
妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT）
头孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）头孢匹肟
头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）头孢他定（CAZ）
左旋氧氟沙星（OFL）亚安培南 哌拉西林/三唑巴坦
3、金黄色葡萄球菌
苯唑西林（OX）青霉素G（P）头孢唑林（CZ）阿米卡星（AN）
红霉素（E）头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）
万古霉素 奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦
头孢噻吩（CF） 
4 、肠球菌
氨苄西林（AM）万古霉素 环丙沙星（CIP）
庆大霉素（GM）红霉素（E） 氧氟沙星（OFL）
5、除肺炎链球菌外链球菌
氨苄西林（AM）头孢噻肟（CTX）万古霉素
红霉素（E） 氧氟沙星（OFL）克林霉素(CM)
肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌和大肠杆菌ESBLs的检测
  MH培养基上贴头孢他定，头孢他定/克拉维酸，头孢噻肟/棒酸，安曲南。
如头孢他定的抑菌圈<22mm，安曲南<27mm，头孢噻肟<27mm，意味可能有ESBLS产生。
如头孢他定/克拉维酸与头孢他定，头孢噻肟/棒酸与头孢噻肟的差值≥5mm，则确证ESBLS产生。
耐药机制。
  一代头孢对普通变形杆菌、枸橼酸杆菌、肠球菌、假单孢菌属、沙雷氏菌属、拟杆菌属无效。第二代头孢对假单孢菌属、不动杆菌属、沙雷氏菌属、肠球菌无效；肠球菌对头孢类天然耐药。氨基糖甙类抗生素阿米卡星与庆大霉素不完全交叉耐药。红霉素类、四环素类等抗生素内部有相互交叉耐药。
  金黄色葡萄球菌耐万古霉素、无乳链球菌耐青霉素和氨苄青霉素、无乳链球菌和D群链球菌耐万古霉素和替拉考宁为不可能的表型。
  洋葱伯克霍德菌对氨基糖甙类、亚安培南天然耐药。
  除表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌外，替拉考宁耐药的凝固酶阴性的葡萄球菌不常见。
  金黄色葡萄球菌对复方新诺明耐药为罕见表型。
氨苄青霉素对非发酵类不宜应用。
对于葡萄球菌，苯唑西林耐药，青霉素敏感是不可能的。
NCCLS关于细菌药敏实验的说明
总评论：
1、头孢噻吩可以代表头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢氨苄、头孢克洛、和头孢羟氨苄。但是，头孢唑林、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢丙烯应单独测试，因为某些对这些药物敏感的菌株对头孢噻吩是耐药的。
2、利福平不能单独用于化疗。
肠杆菌科 
1对于沙门菌属和志贺菌属只有氨苄西林、喹诺酮、和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑可用于常规试验与报告。初此之外，对于沙门菌属和志贺菌属的肠道外分离株，应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素。
2、克雷伯菌属和大肠艾希菌的产ESBLS株对青霉素、头孢菌素类或安曲南临床治疗可显耐药性，尽管在体外药敏试验对其中某些抗生素敏感。对于所有产ESBLs株，应报告为耐所有青霉素类、头孢菌素及安曲南。
3、随着3代头孢菌素的治疗，肠杆菌属、枸橼酸菌属和沙雷菌属可发展其耐药性。最易敏感的菌株在开始治疗3-4天就可变为耐药，因此要反复测试这些菌株。
葡萄球菌
1、   青霉素敏感的葡萄球菌对FDA批准的用于葡萄球菌感染的其他青霉素类、头孢菌素和碳青烯类也是敏感的。青霉素耐药而苯唑西林敏感的菌株对β-内酰胺酶不稳定的青霉素是耐药的，但对其他β-内酰胺酶稳定的青霉素、β-内酰胺酶抑制剂复合药、相关的头孢类和卡巴陪南是敏感的。苯唑西林耐药的葡萄球菌对现在可用的所有β-内酰胺类抗生素是耐药的。因此仅测试青霉素和苯唑西林就可以推知一大批β-内酰胺类抗生素的敏感性与耐药性，不必常规测试其他青霉素类、β-内酰胺类抑制剂复合药、头孢类和卡巴陪南类。
2、   绝大多数的MRS对多种抗生素耐药。包括β-内酰胺类、氨基糖甙类、大环内酯类、克林霉素和四环素。观察到多重耐药应该是对甲氧西林可能耐药的线索。
3、   长期应用喹诺酮类治疗的过程中葡萄球菌可发展其耐药性，因此应重复测试耐药性。
肠球菌
1、   对于肠球菌属，头孢菌素、氨基糖甙类（除了筛选高水平耐药性）、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑在体外可能有活性，但临床无效，因此不能报告细菌对这些药物敏感。
2、   青霉素敏感性可以用于不产β-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿莫西林、酰基氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林以及哌拉西林/三唑巴坦的敏感性
3、   氨苄西林是氨苄西林和阿莫西林类的代表药。氨苄西林的结果可用来判断不产β-内酰胺酶的肠球菌对阿莫西林/克拉维酸和氨苄西林/舒巴坦的敏感性。
4、   青霉素的结果可预测不产β-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿莫西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦的敏感性。
5、   对于血和脑脊液分离株需用头孢硝噻吩β-内酰胺酶试验，阳性提示对青霉素耐药，同时对酰胺基、羧基和脲基青霉素耐药。
细菌鉴别要点
1、   革兰阳性球菌
所有革兰阳性球菌第一步为触酶试验。
通常触酶阳性为葡萄球菌和微球菌，阴性为链球菌科。但不排除例外，气球菌为弱阳性。粪肠球菌偶有阳性。操作触酶试验应尽量避免用铂金取菌环（针）在H2O2 上涂菌，而应先涂菌，在滴H2O2，步骤不能颠倒。因为铂金可以和H2O2产生假阳性反应。H2O2必须新鲜，若放置过久或暴露于光线下容易分解，必须保存于4℃冰箱。实验所用菌须大量，不可挑到琼脂，会产生假阳性。
对触酶阳性的革兰阳性球菌，应继续做玻片法血浆凝固酶试验，此为检出葡萄球菌，如阳性一般为金黄色葡萄球菌；如阴性应做试管法凝固酶实验确证，玻片法仅为筛选实验。血浆凝固酶实验用血浆须用兔或猪血浆，新鲜血浆不稳定，可能发生自我凝集或形成颗粒产生浑浊或产生沉淀而导致判度错误；不可使用人血浆，其含有抑制物质回干扰实验结果。
触酶阴性为链球菌科，根据菌落溶血进行下一步鉴定。а溶血：草绿色链球菌；肺炎链球菌；肠球菌
в溶血：A群链球菌；B群链球菌，部分D群链球菌
肠球菌也有不溶血菌落，不能根据溶血判断肠球菌。链球菌主要实验：胆汁七叶苷，七叶苷，菊糖，CAMP  ，杆菌肽，高盐，奥朴托辛，胆盐溶解。
肠球菌为致病菌，且肠球菌与非肠球菌耐药机制不同，应进行鉴别，肠球菌分为粪肠球菌和屎肠球菌；非肠球菌分为牛链球菌和马链球菌。肠球菌对青霉素耐药，非肠球菌对青霉素敏感。肠球菌的药敏注意高耐氨基糖甙的细菌，如高耐氨基糖甙则意味氨基糖甙与в内酰胺类药物合用无协同作用。
肺炎链球菌与草绿色链球菌鉴别：肺炎链球菌奥朴托辛、菊糖、胆盐溶解实验皆为阳性。但这3个实验都非特异，需联合应用方为最佳。肺炎链球菌的青霉素药敏实验应注意，当青霉素（K-B法）的抑菌圈直径大于或等于19mm时为敏感，当小于19mm时不能确定是否中敏或耐药，应做MIC稀释确证。
2、革兰阴性杆菌
包括肠杆菌科、非发酵菌和弧菌科。
第一步实验为氧化酶实验。
氧化酶阴性为肠杆菌科；阳性为非发酵菌和弧菌科。
肠杆菌科包括大肠杆菌、变形杆菌、普罗菲登斯菌及摩根菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、耶尔森菌属。非发酵菌包括铜绿假单孢菌、黄单孢菌、不动杆菌等。
氧化酶实验注意事项：①需用铜绿假单孢菌做阳性对照。
②60秒内判读结果有效，而以10秒内最佳。③不要用含微量铁的取菌环或针，可用棉棒替代。
革兰阴性杆菌的鉴定以API系列为国标，其他生化管仅为常规鉴定。 
  
   

 

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