头孢拉定胶囊为第一代头孢菌素类抗生素,临床上常用于头孢拉定敏感细菌所致的急性咽炎、急性扁桃体炎、中耳炎、支气管炎、肺炎等呼吸道感染、泌尿生殖道感染及皮肤软组织感染等。此类抗细菌药品在进行微生物限度检查时,需采用适宜的方法消除药物抗菌活性的干扰,才能保证其检验方法的科学性及检验结果的准确性。
本试验用2005年版中国药典规定的3株细菌、2株真菌,采用不同的方法对3批头孢拉定胶囊进行了微生物限度检查方法的验证试验,以建立头孢拉定胶囊的微生物限度检查方法。
1、材料
1.1仪器：电子天平；台式低速离心机；集菌仪。
1.2、培养基 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁培养基、营养肉汤培养基BL培养基、MUG培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.3 供试品：头孢拉定胶囊批号为200609020060902、20060903)。
1.4菌种：大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌LCMCC(B)26003]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]。
2、方法与结果
2.1菌液制备 将上述5株菌的新鲜培养物分别接种至规定培养基,细菌培养16h;酵母菌培养24h;霉菌培养5d,制备成菌孢子悬液,备用。
2.2供试液制备 按规定取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋包监缓冲液至100ml,在45℃水浴中保温使囊壳溶解,混匀,即为1:10供试液;按规定取供试品10g采用无菌操作,将囊壳与内容物分离,称量于同一容器中,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混合均匀,立即吸取混悬液置离心管中,500r•rmin-1离心4min,取上清液为1:10供试液。
2.3细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证
2.3.1取供试液适量和50～100CFU试验菌,分别注入同一平皿中,倾注相应琼脂培养基后,培养计数,为试验组;同法取试验菌加入量,测定所加的试验菌数,为菌液组;取供试液加入量测定供试品本底菌数,为供试品对照组;按以下公式:回收率%=[(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数]×100%计算回收率。
2.3.2 霉菌和酵母菌预试验 取供试液①1，0.5mL分别注2皿为一组,每组加入1种真菌试验菌菌液,共2组。1,0.50mL/皿2株菌回收率均为70%以上。
2.3.3 细菌预试验
2.3.3.1 取供试液 ①1；0.5；0.33；0.25；0.2；0.1mL分别注2皿为一组,每组加入1种细菌试验菌菌液,共3组。3株菌回收率均为0%。
2.3.3.2 取供试液 ②1；0.50；0.33；0,25；0.2；0,lmL分别注2皿为一组,每组加入1种细菌试验菌菌液,共3组。3株菌回收率均为0%。
2.3.3.3 取供试液 ②每10ml离心后的上清液全量加至装有适量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液容器中,采用薄膜过滤法,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗,在最后一次冲洗液中分别加入50～100CFU试验菌,取膜分别贴于营养琼脂培养基上,培养计数,为试验组,3株试验细菌每膜冲洗200、300mL,其中300mL冲洗量的菌回收率可达70%以上;菌液组、供试品对照组同法测定。
2.3.3.4 稀释剂对照组 取pH710无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液适量,共3份,分别加入3株试验细菌菌液,使最终菌浓度50～100CFU/mL,以下操作同2131313。
2.3.3.5 根据以上试验结果,大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌采用低速离心加薄膜过滤法,2株真菌采用常规法1mL•皿进行验证试验,
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