实验十三 放线菌形态的观察

一、基本原理
　　和细菌的单染色一样，放线菌也可用石炭酸复红或吕氏碱性美蓝等染料着色后，在显微镜下观察其形态。玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片基本相同，使放线菌生长在玻璃纸琼脂平皿上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上，用显微镜即可观察到放线菌自然生长的个体形态。
　　放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。
二、器材
　　细黄链霉菌（5406放线菌，Streptomyces microflavus）或灰色链霉菌（S．griseus）；弗氏链霉菌（S．fradiae）；
　　石炭酸复红染液，吕氏碱性美蓝染液，加拿大树胶，玻璃纸，高氏1号培养基；
　　显微镜，载玻片，盖玻片，玻璃棒，接种铲，小刀，镊子等。
三、操作步骤
1．放线菌自然生长状态的观察
(1)将灭菌后的高氏1号培养基倒入培养皿，每皿倒15ml左右，凝固后备用。
(2)用经火焰灭过菌的小镊子将灭菌优质玻璃纸平铺在平皿培养基上，如果琼脂培养基和玻璃纸之间有气泡，可以用灭过菌的玻璃棒将气泡除去。
(3)将3—5ml无菌水倒入弗氏链霉菌的斜面培养物里，制成菌悬液，再适当稀释。
(4)用无菌吸管取0．1ml的孢子悬液稀释液，接种在玻璃纸上，并用无菌玻璃棒涂匀后，置28℃培养，直至菌长好，备用。
(5)在洁净的载玻片上滴一小滴水，稍涂布。取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀剪取小片长有菌的玻璃纸，菌面朝上放在载玻片的水面上，使纸平贴载玻片。
(6)将载玻片置显微镜下观察。
　　附：玻璃纸灭菌方法在玻璃纸灭菌时，若直接将干燥的玻璃纸灭菌，它就会缩小，不便使用。故需作如下处理：将玻璃纸和滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片，用水浸泡后把湿滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。
2．营养菌丝的观察
(1)用接种铲连同培养基挑取细黄链霉菌菌苔置载玻片中央。
(2)用另一载玻片将其压碎，弃去培养基，制成涂片，干燥、固定。
(3)用吕氏碱性美蓝染液或石炭酸复红染液染0．5—1分钟，水洗。
(4)干燥后，用油镜观察营养菌丝的形态。
3．气生菌丝与营养菌丝的比较观察
(1)将高氏1号培养基倒入无菌培养皿，制成4mm左右的培养基平板，经培养检验后无菌，备用。
(2)用火焰灭菌的镊子将无菌盖玻片以45度倾斜角插入平皿培养基琼脂内，然后将细黄链霉菌的孢子悬液（浓度以稀释10-2—10-3为好），接种在盖玻片与平皿培养基的界面上。
(3)倒置于28℃培养4—5天后，小心地将盖玻片取出，把有菌的一面朝上，放在载玻片上，置显微镜下进行观察。一般情况是气生菌丝颜色较深，并比营养菌丝粗二倍左右。
4．孢子丝及孢子的观察
(1)将培养3—4天的细黄链霉菌的培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察气生菌丝和孢子丝的形态，注意其分枝情况、卷曲情况等。
(2)取清洁的盖玻片一块，在菌落上面轻轻按压一下，然后将印有痕迹的一面朝下放在有一滴吕氏碱性美蓝染液的载玻片上，将孢子等印浸在染液中，制成印片。用油镜观察孢子的形状、孢子丝等。
(3)取干净载玻片一块，在玻片中央加一小滴加拿大树胶，使树胶摊成一薄层，放置数分钟，使略微晾干（但不要过分干燥）。然后用小刀切取细黄链霉菌培养体一块（带培养基切下）。将培养体表面贴在涂有树胶的玻片上，用另一玻片轻轻按压（不要压碎），然后将放线菌培养体小心弃去，注意不要使培养体在玻片上滑动，否则印痕模糊不清。将制好的印片通过火焰固定，用石炭酸复红染色1分钟，水洗，晾干（不能用吸水纸吸干）。用油镜观察孢子丝的形态及孢子排列情况。
四、实验报告   
   

 

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