进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法——2

6.1 样品的存放与制备如为冷冻样品应于2℃~5℃解冻，且不超于18h，若不能及时检验，应置于-15℃保存，非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检验。
无菌取样品25g（ml）放入灭菌均质杯或均质袋中加225mLPBZE增菌液中，充分均质。
6.2 增菌培养
FB1增菌液225ML放30℃±1℃培养25h±1h吸收1ml加入10mlFB2增菌液中放30℃±1℃二次增菌25h±1h.
6.3 VIDA8快速筛选
取FB2增菌液，可按仪器生产厂的说明采取VIDA8快速筛选法进行快速筛选检测，75min可获初步结果。对于筛选为阴性的结果可直接按8.2报告来检出单核细胞李斯特氏菌。对于筛选为阳性的结果按照6.4和6.9的条款进行分离培养和鉴定。
6.4 分离培养
6.4.1 选择性培养基的分离培养
取增菌液一杯，划线分离于选择性培养基OXA、PALCAM琼脂平板上30℃±1℃培养24h~48h
6.4.2黑色菌落观察
李斯特氏菌在OXA琼脂平板上生长24h后菌落呈现黑色，直径为4mm，在其周围形成一个黑色环，培养48h，菌落仍呈黑色，直径2mm~3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在PALCAM琼脂平板上与在OXA琼脂平板上的菌落相似。
在OXA琼脂平板和PALCAM琼脂平板上挑选5个或更多可疑菌落，接种于TSA-YE琼脂平板上，纯培养后进行鉴定。
6.5 鉴定
6.5.1 蓝色菌落鉴定
用45°斜射光照射TSA-YE琼脂平板，菌落呈现蓝灰色到蓝色，用标准菌株作为阳性对照，将纯化后的菌落接种于TSB-YE肉汤，30℃培养24h，供生化等项目检验使用。
6.5.2 类型运动镜检
挑选在TSA-YE琼脂平板上生长良好的菌落于洁净载玻片上，用0.8%生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片，于显微镜下观察，李斯特氏菌为短棒状杆菌，可见轻微的旋转翻滚。用标准菌株作为对照。
6.5.3 革兰氏染色
按照GB/T4789，38-2003进行革兰氏染色李斯特氏菌显短杆状革兰氏阳性反应。
6.5.4 过氧化氨酶实验
挑取TSA-YE平板上的菌落于洁净载玻片上，滴加1滴3%过氧化氢（H2O2）溶液，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。
6.5.5 溶血实验
将7%羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格，每格刺种一个菌落，从每个TSA-YE琼脂平板上至少挑取2个菌落刺种血平板，并刺种阳性对照菌（单核细胞增生李斯特氏菌利绵羊李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h~48h，穿刺应刚刚透过琼脂层，尽量避免接触平板底部时太猛烈和和使琼脂破裂，于明亮处进行观察，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌在刺种点周围产生窄小的透明β型溶血环，绵羊李斯特氏菌产生大的β型溶血环，其他李斯特氏菌种不产生溶血环，
6.5.6动力试验
将TSB-YE肉汤培养物穿刺接种于SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）培养48h,李斯特氏菌有动力，在半固体试管内呈典型伞状生长。
6.5.7硝酸盐还原试验
用TSB-YE肉汤培养物接种与硝酸盐肉汤中，于35℃培养5d,加入0.2ml试剂A，再加入0.2ml试剂B,轻摇混合，如在1min～2min内出现红色，判断为阳性反应，如果没有颜色显现，在含有试剂A和试剂B的试管内再加入少量锌粉，（约20mg）放置1h,如出现红色，表示仍有硝酸盐存在，未被细菌还原，判断为阴性。
6.5.8 MR-VP试验
将TSB-YE肉汤培养物接种与MR-VP肉汤中，于35℃培养48h，移取1ml培养物于洁净试管中，加5%α-萘酚溶液0.3ml，在加4%氢氧化钾溶液0.2ml，轻轻摇动试管约1min，静置约20min，出现红色为VP阳性反应，将剩余培养液继续与35℃培养48h，加甲基红指示剂1滴于试管中，出现红色为MR阳性反应，李斯特氏菌均为MR-VP阳性反应。
6.5.9 三糖铁试验
用TSB-YE肉汤培养物接种于三糖铁琼脂（TSI）,于35℃培养5d，李斯特氏菌在斜面和底层产酸，不产硫化氢   
   

 

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