中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠——2

检验步骤
6.1前增菌、增菌和分离6.1.1沙门氏菌的前增菌、增菌和分离，按GB/T4789.4进行。6.1.2志贺氏菌的增菌和分离，按GB/T4789.5进行。6.1.3致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离，按GB/T4789.6进行。6.2噬菌体试验6.2.1培养基准备营养琼脂平板（含琼脂1%——1.5%，琼脂量视其凝固性而定，约为一般用量的四分之三），每个90mm培养皿中约25ml，放在水平台面上挨其凝固，翻转平板，在36℃半开皿倒置约lh，以烘干培养基表面水分，并便琼脂具有显著的吸水性6.2.2试验菌液的准备从选择性鉴别平板上挑取菌落，一般应多挑几个菌落，以防遗漏。检验沙门氏菌时，不俱应挑取乳糖阴性产H2S和不产H2S的菌落，还应挑取乳糖阳性产H2S的菌落。检验大肠埃希氏菌时应挑取乳糖阳性或阴性的菌落3个～5个。检验志贺氏菌时应挑取可疑菌落接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体管，于36℃培养过夜，次日选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产H2S．不产气无动力的培养物。下述两种方法可供选用．6.2.2.1一法：将待试菌落接种于营养肉汤管内，于36℃培养过夜。挑取此肉汤培养物一满环，稀释于盛有1mL——2mL蛋白陈水的试管内，使成为（1：200）一（1：400）稀释菌液，含菌量约为l*l0（6）/mL。
6.2.2.2二法：用接种针在鉴别平板上轻轻蘸取可疑菌落，挑取菌量不宜过多，稀释于盛有1ml——2mL蛋白陈水的试管内，使其含菌量约与一法相似。6.2.3涂抹试验菌液6.2.3.1斑点涂抹法：将营养琼脂平板表面自圆心起分为三等份．每等份可供涂抹一株细菌培养物，每挑取试验菌液一满环，徐抹直径约1cm的菌斑一个。每株培养物涂抹七个菌斑，外圈四个，内圈三个。6.2.3.2棉签涂抹法：用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面三分之一的区域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离。略等数分钟，待菌液干燥。6.2.4滴加噬菌体  用定量乳头滴管在一个菌斑上滴加噬菌体一滴，依次为分O-I、C、Sh、E、CE、E4和Ent。滴管上安装4号针头，每毫升约为100滴。每支滴管只滴加一种噬菌体，针尖绝对不能接触平板表面，严格防止交叉污染。每用一支滴管，可把全部待试菌应滴加噬菌体的菌斑部位全部滴加完毕。滴加噬菌体时必须将琼脂平板放在水平台面土。7种噬菌体滴加完毕后，略等数分钟，待噬菌体液干燥。翻转平板，放36℃ 培养5h一6h，并过夜各观察一次结果。  如果仅有一两株培养物作噬菌体试验，则可用直径为3mm的接种环挑取噬菌体，依次滴加在菌斑上。灼热的接种环必须究全冷却以后方可挑取噬菌体。6.2.5试验结果的判定   按表1判定噬菌体试验的结果。必要时吸取少许剩余的蛋白脉水培养物作靛基质试验，大肠埃希氏菌培养物一般为靛基质阳性。
6.2.6供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法
采用如下三种噬菌体：
a）沙门氏菌C-I噬菌体
b）E多价噬菌体，包括E和SH
C）C多价噬菌体，包括C、CE、Ent
6 . 3噬菌体不裂解培养物的补充生化试验
有少数的沙门氏菌培养物不被住工噬菌体裂解，并有少数的大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体
 
培养基和试验菌液的准备同前法。 
  涂抹试验菌液：斑点涂抹法将琼脂平板表面分为四等份，每等份可供涂抹一株细菌培养物。每株培养物涂抹三个菌斑，外圈两个，内圈一个。棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，每个平板约可涂抹五条菌带。略等数分钟，带菌斑干燥。
  依次滴加上述三种噬菌体，在36℃培养5—6h和过夜，各观察一次结果。按表2判定简化诊断法的结果。
表2   三滴法噬菌体试验简化诊断表
O-I   E多价  C多价   判定结果
CL      -      -      沙门氏菌属
*       CL     *       大肠埃希氏菌
-       -     CL       弗劳地氏柠檬酸杆菌a
-       -     -        噬菌体阴性培养物
注：CL 融合性裂解  ；- 不裂解 ；* 裂解或不裂解 ；a 包括阴沟肠杆菌和少数大肠埃希氏菌。
6.3噬菌体不裂解培养物的补充生化试验
   有少数的沙门氏菌培养物不被O-I噬菌体裂解，并有少数的大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解，故应将不被各种噬菌体裂解的培养物接种三糖铁琼脂，以下分别按GB/T4789.4和GB/T4789.6进行。6.4血清学分型鉴定6.4.1沙门氏菌按GB/T4789.4进行。6.4.2致泻大肠埃希氏菌按GB/T4789.6进行．6.4.3志贺氏菌6.4.3.1记录噬菌体试验的结果，并按表3判定血清学分型鉴定的方向。Sh噬菌体不裂解的培养物不属于志贺氏菌。已知全部志贺氏菌培养物均能被Sh噬菌体裂解，且将其稀释至1 RTD时，有的写的志贺氏菌培养物仍应被裂解。表3噬菌体试验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的方向   
   

 

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