验证试验条件——2

4、具抑菌性样品的验证方法：对这类供试品，首先要通过抑细菌、抑真菌试验以验证、确定其是否具有抑菌作用，然后才选择适合的检验方法。对有抑菌作用的样品验证消除其抑菌性的方法。通常采用中和产品抑菌性的方法，一般有3种，可将这些方法的2个或3个组合在一起使用。这3种方法是： 
（1）化学钝化中和法（又称化学试剂中和法）  常用的钝化剂有对氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯80等。表列出了用于消除药品抑菌性的常见化学中和剂，及其对某些微生物的潜在毒性。尽管化学中和剂对某些微生物有毒性，但因其中和速度快，且使用方便，所以被广泛应用。在防腐剂抑菌效力试验中采用化学钝化试剂中和法，无菌检查法中的膜过滤法和直接接种法也可考虑使用化学钝化中和剂。有些对化学中和剂不敏感的抑菌性药品，可采用酶法中和（如青霉素酶）。 

表  中和化学抑菌剂的常用中和剂
中和剂	化学抑菌剂的类别	中和剂的潜在抑菌性
硫酸氢盐	戊二醛	非芽孢细菌
稀释剂	酚类、乙醇、乙醛、山梨酸酯	—
甘氨酸	乙醛	生长细胞
卵磷脂	季铵盐类化合物、对羟基苯 甲酸酯类	细菌
Mg或Ca离子	EDTA	—
聚山梨酯	季铵盐类化合物、碘、对羟基苯 甲酸酯类	—
硫基醋酸盐	汞制剂	葡萄球菌类和芽孢
硫代硫酸盐	汞制剂、卤化物、乙醛	葡萄球菌类

       
（2）稀释中和法：将样品稀释至最低抑菌浓度以下进行检查。 
 由于化学抑菌剂的抑菌效果与其浓度呈正相关，即浓度越高，抑菌作用越强。常用稀释法来中和检品的抑菌性。不同抑菌剂的浓度与其抑菌效力间的相关性不同，但对某一特定的抑菌剂来说，这种相关性是恒定不变的，二者呈指数关系，可用下式表示：
Gηt=k 
式中，G表示抑菌剂的浓度；t表示杀灭标准试验菌株所需要的时间；k是一个常数；浓度指数η，是lgt与lgC作图所得直线的斜率。抑菌剂的η值越高，其抑菌作用越易通过稀释而被中和掉；抑菌剂的η值越低，则越难通过稀释法来中和消除其抑菌力。 
（3）薄膜过滤中和法：薄膜过滤中和法使用最广泛，在药品微生物学检测中，尤其是无菌检查中常用薄膜过滤来消除药品的抑菌性。该法的原理是：当抑菌性产品通过滤膜过滤时，微生物被截留于滤膜上，然后，培养滤膜看其是否有微生物生长。残留于滤膜上的抑菌成分会抑制微生物生长，应尽可能采用对检品具有低吸附性的滤膜（如聚偏二氟乙烯 ），将抑菌效果降到最低。此外，对含防腐剂的产品，可通过稀释或淋洗滤膜来削弱抑菌力，所用稀释液或淋洗液应比较温和，如0.1%蛋白胨溶液与pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，适用于水溶性产品，含 0.1%聚山梨酯（吐温-80）的0.1%蛋白胨溶液，适用于含卵磷脂或油类药品。淋洗液 中所用 的化学钝化（中和 ）剂应确保滤膜上的抑菌性残留物不会对微生物生长产生不良影响。 
5、青霉素类或头孢类产品无菌检查用培养基的处理：如采用直接接种法对此两类药物进行无菌检查，可按以下方法调整硫乙醇酸盐肉汤培养基及大豆胰蛋白胨液体培养基的配方，无菌操作向已灭菌的培养菌容器内加入一定量的β-内酰胺酶，使检品中的抗生素失活。（事先测出β-内酰胺酶对青霉素或头孢素的中和效力，再确定其用量，加有β-内酰胺酶的培养基也可用于薄膜过滤法）。β-内酰胺酶的加入量需通过验证。 
  在与细菌试验环境完全隔离的区域内进行，确定β-内酰胺酶的用量，将数量不超过100个菌（CUF）的球菌接入培养基内。若能观察到接入菌种的典型生长现象，则证明β-内酰胺酶的加入量是合适的。                       
6、培养条件：微生物的生长条件也是准确测定微生物含量的重要前提条件。首先要选择能使特定样品中微生物能生长的适宜培养基（可通过细菌生长试验证实），其次是确定培养的温度和时间。可根据不同的检查项目选用各类培养基，通常营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，以及大豆胰蛋白胨琼脂、肉汤等基础培养基，因其生长菌谱广，适宜大多数细菌生长，而常被用于一般 的细菌检测和培养。同样，硫乙醇盐酸琼脂或肉汤常被用于需气、厌气菌的检测和培养，萨布罗葡萄糖琼脂（SDA）或玫瑰红钠琼脂培养基适宜霉菌生长而常被用于真菌（酵母菌、霉菌）的检测和培养。如果样品本身就有抑菌作用，可向上述培养基中添加适量的中和剂（如聚山梨酯、卵磷脂等）。使用培养基前，按规定应先检查其灵敏度和无菌性。培养的温度和时间也非常关键，总之，验证实验所采用的培养条件必须要与实际检验的培养条件相一致，以保证实验的真实性与重现性。    
   

 

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