生物灭菌指示剂（湿热法）的原理和使用

一、生物灭菌指示剂

   生物灭菌指示剂是常用来检测灭菌效果的方法之一，对于湿热灭菌法，一般常用嗜热脂肪地芽孢杆菌（也可使用其他等效耐热的菌株）的芽孢进行测试。目前市场上已有多种品牌和形式的灭菌指示剂，常见的一般有纸片形式的和安瓿瓶（或其他玻璃管形状）的产品。

  嗜热脂肪地芽孢杆菌（原名嗜热脂肪芽孢杆菌，后重新划分归属于地芽孢杆菌属，因此改名为嗜热脂肪地芽孢杆菌）对热有很强的耐受性，芽孢体耐热性更强，因此常用其芽孢制作生物指示剂。嗜热脂肪地芽孢杆菌最适生长温度在55℃左右，大多数菌株生长温度范围在40℃-65℃，能发酵葡萄糖产酸，因此常用溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水（BCP）检测其芽孢体是否存活。

二、生物指示剂的组成和制作

  若实验室中有嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株，也可自行制作生物指示剂进行测试。首先将嗜热脂肪地芽孢杆菌接种至锰盐营养琼脂平板（因培养温度较高，培养时间较长，平板需厚一些，也可使用锥形瓶做大斜面），55℃培养5-7天左右，可形成比较丰富的芽孢，将菌苔从平板上用生理盐水或磷酸盐缓冲液洗下，100℃加热30min可杀死繁殖体留下芽孢，稀释后可采用涂布或倾注法计数（通常使用DTA琼脂，若没有使用TSA也可以，置55℃培养24-48h），测定芽孢悬液浓度。

  将定量体积的芽孢悬液加入至纸片上干燥处理，使纸片中含有的芽孢数大约在1-5×10⁶CFU即可，搭配溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水管即可进行灭菌效果测定了。也可以将芽孢悬液加入至定量体积的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水中（通常可以用0.5-2mL，含芽孢量10⁶CFU）使用。制备好的指示剂可在2-8℃冰箱内冷藏。

三、灭菌生物指示剂的使用

  对于纸片的生物指示剂，放入灭菌锅中按照固定程序灭菌后，将纸片放置于5mL的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水管（通常商品化培养基已配备）中55℃培养不少于7天，若出现变黄反应，说明芽孢未被杀死，灭菌效果不达标。

  对于较大体积培养基的灭菌效果测试，则应考虑使用密封的玻璃管装的灭菌指示剂放入培养基的内部进行监测，确认培养基的内部是否达到了相应的灭菌效果（特别是灭菌体积较大、容器密闭的情况下，更需要注意检测容器内部是否达到了相应的灭菌效果）。密封的玻璃管装灭菌指示剂使用后直接置于55℃培养不超过7天即可，观察是否有变黄现象出现。未使用的保存管应置于冷藏保存（若储存环境温度过高会导致芽孢萌发，培养基变黄）。

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