人肺炎支原体、猪肺炎支原体、口腔支原体固体平板法及染色镜检

刘浩然
录入时间:2024-1-24 10:30:52 来源：青岛海博生物

一、支原体简介

支原体结构简单，缺乏细胞壁，仅有质膜，胞体内有核蛋白体以及一个由环形双链DNA分子组成的原核。支原体大小仅有0.1μm~0.3μm，最小直径约为100nm，可通过细菌滤器，会干扰细胞培养等工作的进行。由于其能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。

不同支原体利用的能源物质不同，如肺炎支原体、人型支原体等可发酵葡萄糖，口腔支原体可水解精氨酸，还有解脲支原体可利用尿素作为能源。我们可通过发酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反应鉴别支原体。

支原体营养要求一般比细菌高，除必须的基础营养物质外，还需添加10%~20%的动物血清以提供支原体所需的助生长因子。由于大多数的支原体兼性厌氧，有些菌株在活化分离时保持5%~10%二氧化碳环境生长状态更好。解脲支原体在厌氧条件下生长更好。

支原体无细胞壁，对渗透压敏感，对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感，因此可添加青霉素抑制细菌的生长。由于渗透压突变会导致支原体破裂死亡，因此培养支原体时，维持适宜的渗透压显得格外重要。此外，在支原体培养中，pH也是重要因素。

支原体在固体平板培养基上的菌落状态为煎蛋状，这种菌落状态也是因为支原体没有细胞壁的缘故，支原体向培养基内部生长形成“蛋黄”部分，支原体在培养基表面生长便形成了“蛋清”部分。

二、肺炎支原体、口腔支原体检验依据及原理

人肺炎支原体检查法在2020年版《中华人民共和国药典》中体现，要求使用支原体肉汤培养基（货号为HB7025-2，可参考文章支原体肉汤培养基的原理和使用方法）培养监测肺炎支原体。具体操作要求为：将肺炎支原体稀释至10^-7~10^-9，接种在支原体肉汤培养基中，每个稀释度接种3支试管，置于36℃培养7-14天，观察培养基变色结果。肺炎支原体可以发酵培养基中的葡萄糖，使培养基的pH值降低，遇指示剂酚红使培养基变黄。

猪肺炎支原体检查的方法在中国药典中无具体要求，我们可以参照人肺炎支原体检查法。

口腔支原体检查法在2020年版《中华人民共和国药典》中体现，要求使用精氨酸支原体肉汤培养基（货号为HB7025-5）培养监测口腔支原体。具体操作要求为：将口腔支原体稀释至10^-3~10^-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基中，每个稀释度接种3支试管，置于36℃培养7-14天，观察培养基变色结果。口腔支原体可以利用培养基中的精氨酸，使培养基pH值升高，遇指示剂酚红使培养基变红。

三、支原体固体平板培养的方法

1.取活化的人肺炎支原体（活化支原体的方法可参照视频：肺炎支原体的灵敏度试验方法）、猪肺炎支原体分别接种至支原体肉汤中，并进行10倍梯度稀释，涂布适宜浓度的稀释液100μL至支原体琼脂固体平板上（货号为HB7025-3），封口膜包住平板边缘以提供微需氧环境且能有效避免一定的污染，直到培养至光线下可以看到针尖大小的菌落，人肺炎支原体在平板上及镜检下的菌落状态如图1所示。

图1 人肺炎支原体在平板上及镜检下的菌落状态

猪肺炎支原体在平板上及镜检下的菌落状态如图2所示。

图2 人肺炎支原体在平板上及镜检下的菌落状态

2.取活化的口腔支原体接种至精氨酸支原体肉汤中，并进行10倍梯度稀释，涂布适宜浓度的稀释液100μL至支原体琼脂固体平板上（使用货号为HB7025-1；较HB7025-3不同点在于含精氨酸和酚红），封口膜包住平板边缘以提供微需氧环境且能有效避免一定的污染，直到培养至光线下可以看到针尖大小的菌落，口腔支原体在平板上及镜检下的菌落状态如图3所示。

图3 口腔支原体在平板上及镜检下的菌落状态

四、支原体染色方法及染色后镜检结果

为了增加颜色的对比度，更好的观察检测支原体，可采用加染色液的方法对支原体进行染色，染色还可有效排除气泡的干扰。中国药典采用的为指示细胞培养法即DNA染色法，需要借助特殊的荧光染料和荧光显微镜进行观察。而一般的实验室并不具备这样的条件，因此可以使用更为简单的染色方法，借助两种常用的染料及普通电子显微镜即可观察。具体步骤为：将蕃红染液或结晶紫染液（革兰氏染色A液；HB8278）稀释一定的倍数，直接加入到平板上染色10秒，之后用水冲洗掉，无需切割琼脂块，直接将平板放置于显微镜观察，人肺炎支原体的染色镜检结果如图4所示。