质粒载体

质粒（plasmid）是一类双链闭合环状DNA分子的总称，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在，可以自我复制。一个质粒就是一个DNA分子，其大小从1kb到200kb（1kb=1000碱基对）。质粒广泛存在于细菌中，某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。从不同细胞中获得的质粒性质存在很大的差别。

常用的细菌质粒有F因子、R因子、大肠杆菌素因子等。F质粒携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息，R质粒则含有抗生素抗性基因。还有一些质粒携带着参与或控制一些特殊代谢途径的基因，如降解质粒。

虽然质粒的复制和遗传独立于染色体，但质粒的复制和转录仍依赖于宿主所编码的蛋白质和酶。每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，使质粒DNA能在宿主细胞中自我复制。按复制方式，质粒分为松弛型和严紧型质粒。松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，而完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶来进行，这样，即使在没有进行蛋白质合成时，松弛型质粒仍然能够复制。松弛型质粒在每个细胞中可以有10～100个拷贝，又称为高拷贝质粒。严紧型质粒的复制则要求同时表达一种由质粒编码的蛋白质，在每个细胞中只有1～4个拷贝，称为低拷贝质粒。在基因工程中一般都使用松弛型载体。

pBR322是人们研究最多、使用最广泛的载体，具备一个好载体的所有特征。pBR322大小为4363bp，有一个复制起点、一个抗氨苄青霉素基因和一个抗四环素基因。质粒上有36个单一的限制性内切酶位点，包括Hind Ⅲ、EcoR I、BamH I、Sal I、Pst I、Pvu Ⅱ等常用酶切位点。而BamH I、Sal I和Pst I分别位于四环素和氨苄青霉素抗性基因内。应用该质粒的优点是：将外源DNA片段在BamH I、Sal I或Pst I位点插入后，可引起抗生素抗性基因失活，从而能方便地筛选出重组菌。如将一个外源DNA片段插入到BamH I位点时，四环素抗性基因（Tet）失活，因此就可以通过Amp^r Tet^s平板筛选重组菌。

将纯化的pBR322质粒用一种位于抗生素抗性基因中的限制性内切酶酶解后，产生了一个具有黏性末端单链的线性DNA分子，把它与用同样的限制性内切酶酶解的目的基因混合，在ATP存在下，用T₄DNA连接酶连接处理后，形成了一个重组的环型DNA分子。连接产物中可能包含一些不同连接的混合物，如质粒自身环化的分子等，为了减少这种不正确的连接产物，酶切后的线性分子需先用碱性磷酸酶处理以除去质粒末端的5'磷酸基团。T₄DNA连接酶不能把两个末端都没有磷酸基团的线状质粒DNA连接，就减少了自身环化的可能性。

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