示踪剂技术

为了确定构成最终产物分子的初级代谢产物“建筑构件”的来源，一种最有用的技术是应用放射性同位素标记的示踪剂。将具有放射性同位素¹⁴C、³H或¹³C标记的抗生素生物合成前体物质加人生产该抗生素的微生物培养基中，最佳加人时间是微生物生长阶段的末期，当培养结束后，将抗生素分离、提纯，然后测定结合到抗生素分子中的同位素，从放射性同位素的计数就可以获得前体物质结合到抗生素分子的程度。在分析数据时应该注意两点：一是示踪物质虽然是抗生素合成的前体物质，但由于不能通过微生物的细胞壁吸收而得出不是前体物质的错误结论，事实上如果该物质能够进人细胞内就可以结合到抗生素分子中；二是在抗生素分子中虽然检测出了示踪物质，但示踪物质已经在细胞中通过其他代谢途径降解，真正结合到抗生素分子的是示踪物的降解产物。为了避免上述误差，可以采用双重标记的示踪物，如前体分子同时有¹⁴C和³H的标记。

在确定了抗生素分子中结合进去了某一前体物后，下一个任务是确定该前体在抗生素分子结构中的位置，这样就要将抗生素分子降解为一定的小片段，然后确定标记物在哪一个片段中，这是一个困难而又耗时的工作。一个比较有效的替代方法是用¹³C标记的前体物。¹³C在自然界的丰度有11%，表面看来似乎会干扰测定结果，但它的优点是能够合成¹³C的含量高达99%的化合物，因此自然丰度的干扰可以忽略不计。将用¹³C合成的前体加入培养基中进行抗生素发酵，得到的产物可以直接用核磁共振（NMR）谱峰的高度增加值判断抗生素分子的每个碳原子中¹³C所占的分数。如能采用双重标记的前体物，则可以根据谱峰多重性的高分辨分析和偶合常数来判断两个原来相连的原子在经过复杂的代谢过程后是否还继续相连，或连接键虽然已经断裂但经不同的途径结合到了抗生素分子中。

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