黑曲霉的活化、保存及孢子悬液制备

一、黑曲霉简介

  黑曲霉（Aspergillus niger）为曲霉属真菌中一个常见种，在自然界中广泛存在，生命力强，在马铃薯葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖琼脂上生长初期产生白色菌丝，长大后逐渐变黄，随着培养基内营养的不断消耗，菌丝的顶端逐渐产生灰黑色的孢子。

二、活化方法

  黑曲霉的活化可以使用沙氏葡萄糖液体/琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂/马铃薯葡萄糖水等常用的真菌类培养基，也能在胰酪胨大豆琼脂、营养琼脂等细菌培养基上生长，而实验室培养黑曲霉通常需要用到孢子进行各种测试，一般建议使用固体培养基（SDA或PDA）进行活化。

  注：若需要用到黑曲霉的孢子，通常需培养至较长时间（一般为5-7天左右）可产生丰富的孢子，选择较低营养的培养基有时候可以更快获得孢子，培养时还需注意保持良好的透气性，有助于霉菌的快速生长和孢子的产生。

培养初期，黑曲霉产生白色菌丝，向周围扩散生长

培养时间延长，培养基内营养逐渐被耗尽，菌丝颜色开始变黄色，并开始产生少量孢子

产孢子量逐渐增加

培养结束后，菌丝顶端产生大量黑色孢子

三、实验室常用保存方法

  1.斜面保存法

  将SDA或PDA制成斜面管，接种黑曲霉后培养至产生丰富孢子，置于2-8℃可保存3-6个月或更长时间，若在表面覆盖无菌液体石蜡隔绝空气和减少水分蒸发，保存时间可延长至一年以上。

  2.甘油冷冻保存法

  可将黑曲霉的孢子悬液加入至甘油保存管中（甘油浓度通常为20%左右，也可使用商品化的液体菌种保存管），置于-70℃以下冷冻保存，一般可稳定保存两年至数年。

  3.瓷珠菌种保存法

  将黑曲霉的孢子转移至瓷珠菌种保存管中，上下颠倒数次，舍弃管内液体，将瓷珠冷冻保存与-20℃或-70℃以下冰箱或液氮罐中，可长期存活（一般在-20℃至少存活一年以上，在-70℃至少存活两年以上）。

  注：黑曲霉的活化和保存通常使用孢子部分。在进行转接培养时，一般需挑取黑曲霉的孢子体转接至另一培养基中进行培养，进行甘油或瓷珠冷冻保存时，也应保存黑曲霉的孢子体。

四、孢子悬液的制作

  在进行培养基的灵敏度检验或者做一些霉菌杀灭效果试验时，通常需要用到黑曲霉的孢子悬液。可将沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂制成斜面培养基（如需要得到大量孢子悬液，可使用锥形瓶制大斜面），接种黑曲霉，培养至产生丰富的孢子，加入一定体积的洗脱液（可用生理盐水、0.1%蛋白胨水、磷酸盐缓冲液等）对斜面进行冲洗，得到高浓度的混悬液，将混悬液通过无菌棉花或纱布进行过滤，除去悬液中可能混入的菌丝体，便可得到孢子悬液。制备好的孢子悬液可放置于2-8℃，在验证过的有效期内保存及使用。

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