细胞培养基的选择

一、培养基介绍

  细胞培养是生物实验里的入门实验也是普遍要做的实验，但细胞培养并不容易。细胞状态的好坏关系着后续实验，诸如筛选药物、转染、提取蛋白（RNA）等的进展。影响细胞状态的因素有很多，包括初始细胞的状态、培养基、血清、孵箱温度、CO2浓度等，我们先考虑培养基和血清的影响。

  一般来说，常用的培养基有很多种，其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他的M199、IMDM、L15等型号培养基等也用于特定细胞的培养。

  ◆ MEM是在Eagle’s基础培养基(BME)基础上，增加了组分的范围及浓度改良而成的，后续产生的迭代产品大多都是在MEM培养基基础上进行的改良。

  ◆ Dulbecco的BEM(DMEM)培养基一开始是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM相比，DMEM增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。与最普通的MEM培养基相比，DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍、且含有非必须氨基酸；维生素浓度是MEM的4倍；含有糖酵解途径中的重要物质--丙酮酸；含有微量的铁离子，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。

  ◆ α MEM是最低必需培养基(MEM)的改良培养基，含有非必需氨基酸、丙酮酸钠、硫辛酸、维生素B12、生物素和抗坏血酸。αMEM  还提供不含核苷的版本，可用作DG44和其他DHFR阴性细胞的筛选培养基。该产品由Earle’s平衡盐制成。αMEM不含蛋白质、脂质或生长因子。因此，αMEM需要补充营养成分，通常需要添加10%胎牛血清(FBS)。αMEM使用碳酸氢钠缓冲系统(2.2 g/L)，因此需要5–10% CO2的环境来维持生理pH值。alpha-MEM培养基中的成分也比MEM要多很多，常被用来培养比较难培养的细胞。

  ◆ DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基（DME/F12medium），作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12（1：1）中加入15mMHEPES缓冲液。

  ◆ Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基被发现适用于多种哺乳动物细胞，包括HeLa细胞、Jurkat细胞、MCF-7细胞、PC12细胞、PBMC细胞、星形胶质细胞和癌细胞。RPMI 1640培养基相比其他培养基具有独特的效果，其中含有还原剂谷胱甘肽和高浓度的维生素。RPMI 1640培养基含有生物素、 维生素B12以及PABA，这些成分是Eagle’s MEM和DMEM所不具备的。

  培养基的种类繁多，那么对于某种细胞应该用哪种培养基呢?其实这个问题的答案要根据细胞来定。如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，可以直接询问供应商，获取相应的实验参数。或者找到使用相应细胞的参考文献，借鉴他人的经验。或者借助各个网站的系统工具，像Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，可以选择细胞类型，系统会推荐合适的培养基、血清和转染试剂等。再比如Sigma网站上也有一个Media Expert的工具，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推荐和参考文献等，对于细胞培养中的常见问题，如细胞贴壁不好、培养基变色等，Media Expert都有列出可能的原因，并提供补救办法。

  但如果是全新细胞的培养体系，找不到参考文献或者技术支持，那就需要慢慢摸索合适的条件了。因为对于不同的细胞没有一个“放之四海而皆准”的条件。但大体上可以先用MEM做贴壁细胞培养、RPMI 1640做悬浮细胞培养尝试一下。也可以购买几种培养基，做一个简单的细胞生长实验，选择生长状态最好的条件。或许摸出的最佳培养条件与文献报道的不同，就算是同一种培养条件，细胞的生长状态也时好时坏，这是很正常的。因为试剂、水、不同批号的血清之间都存在着差异，为了保证实验结果的准确性，这就要提高培养基的稳定性，可以从培养基和血清两方面入手。

  以前大部分实验室用的干粉培养基，是需要自己配制的。但配制过程就较为繁琐，需要溶解干粉、调节溶液的pH值，过滤杂质，一旦过程中有一点小误差，那培养基的稳定性或许就被破坏了。而且有些实验室的水质也是一个问题，不好的水可能会使培养基不能养活细胞甚至染菌，所以培养的效果会有差异。现在大多使用成品的液体培养基，这样人为的误差就可以减少，因为机器大批量工业化生产的，相比人为称量配制的培养基批间差会小很多。

  说完培养基我们来说血清。血清是指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白原已被除去的血浆。其主要作用是：

  ① 提供基本营养物质，氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。

  ② 提供激素和各种生长因子。血清中含有生长因子可促进细胞的繁殖，含有附着因子可促进细胞的贴壁，同时还具有抗胰酶活性。

  ③ 提供结合蛋白，结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

  ④ 提供促接触和生长因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。

可用于细胞实验的血清有胎牛血清、透析型胎牛血清 、天然低IGG胎牛血清 、干细胞培养胎牛血清 、特殊用途胎牛血清 、活性炭/葡萄糖处理胎牛血清 、胎牛血清替代物 、小牛血清 、新生牛血清 、加强型小牛血清 、补铁小牛血清 、成牛血清 、供体马血清 、兔血清 、鸡血清 、猪血清 、马血清 、其他动物血清及合成血清替代品等。其中最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清等。牛血清是按照采血时间的早晚来分类的。采血时间越早，营养物质越丰富，所含抗体也越少，因而胎牛血清适合要求高的细胞系和克隆化培养。由于疯牛病的原因，到目前为止，我国政府仍然禁止从北美洲、欧洲和日本等地区进口牛血清，因此市面上的牛血清大多来自澳洲、南美洲，或是国产的。

  血清是由血浆去除纤维蛋白原而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，这就造成了不同批次血清之间的差异。这种差异来源于不同的制备方法和除菌方法、动物的年龄差别及血清的储存条件等，而且与取血动物的来源关系密切。不同的牧场、不同的气候天气及其他环境因素都可能影响血清的质量。因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制；当选好了一种血清就要尽可能长期使用它。在需要更换时，也要尽量保持与原有的一批血清相似。现在很多公司都提供血清预留，一旦选定了某个批次的血清，最好备足一年的量，这样可以避免很多麻烦。

  血清固然是细胞培养中不可或缺的成分，但血清的批间差异大，更换血清时需要做大量的测试以取保替换的血清与原来的相似。因此，也有一些实验室开始换用无血清培养基。

  无血清培养基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顾名思义，就是在细胞培养中不需要添加血清，但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可简化纯化和鉴定各种细胞产物的程序，避免病毒污染造成的危害。但它也有一些缺点，从有血清培养过渡到无血清培养的条件并不像想象中那么简单。处于发育的不同分化阶段的细胞(例如干细胞与定向前体细胞相比)需要不同的配方，对生长因子和细胞因子的选择尤为重要。而且在去除血清的同时，也去除了一些血清蛋白具有的保护、解毒作用，因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。另外，它的价格也比普通的培养基贵很多。

  现在有很多厂家生产无血清培养基。GIBCO这个细胞培养的金字招牌当然少不了，它也是最早研制无血清培养基的。目前已经开发了ES细胞、杂交瘤、CHO、293、昆虫细胞、神经细胞、淋巴细胞、角质细胞、内皮细胞等多种细胞的无血清培养基。上个月还推出了首个间充质干细胞的无血清培养基，能使MSC维持未分化状态超过9代。HyClone公司也有CHO、293、杂交瘤细胞、昆虫细胞、病毒疫苗细胞的多种无血清培养基。Sigma则刚刚收购了澳大利亚JRH公司，有了JRH的EX-CELL系列，无血清培养基的选择也更多了。

  但不管是新兴的无血清培养基还是传统的有血清培养基，都有其相应的优缺点，选择合适自己细胞培养的条件，并且尽可能保证实验的稳定才是最重要的。

二、注意事项（摘自Invitrogen的中文Focus）

  1. 细胞培养基的储存条件应为2-8℃。如果细胞培养基不小心被冻，应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，应更换培养基。

  2. 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，可能在放置一段时间后颜色变紫。这是由于暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。

  3. 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。正常有血清的培养基，血清蛋白会结合、灭活一些抗生素。但在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，这可能对于细胞达到毒性水平。

  4. 一旦在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

  5. 大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。

  6. 血清的热灭活在免疫分析时可以灭活补体系统。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。热灭活是以往公认的操作步骤，并没有确凿的证据说明这样做是有益的。相反，对大部分细胞而言，GIBCO和HyClone都不推荐热灭活血清。因为加热可能使血清中的沉淀增加，或许会误以为污染。

  7. 在进行传代培养时，推荐进行台盼兰活性记数。研究者常常通过一个简单的稀释(1∶4或1∶2)进行传代，不进行活性检测，可能实际存活的细胞传代浓度要远远低于以为的浓度，这可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。

  8. 贮存在4℃冰箱中的胰蛋白酶溶液只能使用一周。因为胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。

  9. 如果是细胞库内购买的细胞，在订购的细胞到达后，应立即复苏，如果培养基还没有准备好，可将其放入液氮中，仍需尽快复苏。切记不能放置在-20或-80℃的冰箱内。

三、如何避免血清中沉淀物的产生

  1. 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。并随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

  2. 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

  3. 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

来源：天然活性产物发现与靶标鉴定公众号

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