莱氏无胆甾原体相关介绍

1、定义及特点

  莱氏无胆甾原体属于支原体的一种，是最常见的污染细胞培养的支原体菌群之一。细胞培养中常见的支原体有口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、肺炎支原体和发酵支原体，其中前四者占据支原体污染的绝大比例，莱氏无胆甾原体为牛源性。

  支原体是一种大小介于细菌和病毒之间，并独立生活的原核微生物，广泛存在于人和动物体内，只有个细胞膜而没有细胞壁，它不容易受到β-内酰胺传染，不被革兰氏染液染色，单体呈现为多形态（呈现多种形状，从球菌形到棒状，到细丝），大小不一，从0.2μm到0.3μm或更小。莱氏无胆甾体被发现可以穿过0.2μm滤膜，但会被0.1μm过滤器截留，其一般会存在于动物来源物料中，以及通常由动物来源制备的微生物培养基中，支原体的环境监控需要采用选择性培养基（PPLO肉汤或琼脂）。

  大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。

2、检测及鉴定方法：

  （1）分离培养法

  支原体的病原学检测主要是从被污染的细胞、鸡胚中分离培养出支原体来确定，分离培养法是检测支原体污染中最为可靠准确的方法。但是支原体对环境的影响敏感，容易被灭活，而且分离培养操作相对繁琐，所需时间较长，因此只能够对支原体污染进行定性观察。分离培养法在常规的支原体检测中多用于辅助其它检测方法。

  （2）DNA荧光染色法

  DNA荧光染色法较分离培养法缩短了检测周期，主要用于细胞培养中污染支原体的检测。DNA荧光染色法正是利用荧光染色剂双苯咪唑（Bisbenzimidzole）Hoechst33258能够结合支原体DNA中的A-T碱基富集区域的原理，被支原体污染的细胞经染色后，其细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光点，即是富含A-T碱基区域的支原体DNA。

  （3）PCR技术

  PCR根据支原体基因组内的保守序列设计特异引物，对待检样品的核酸进行扩增，通过对扩增产物的大小分析作出诊断。PCR检测技术用于支原体污染的检测，快速、灵敏、特异且简便，应用于科学研究和疾病的诊断。

  （4）酶联免疫吸附试验（ELISA）

  ELISA用于支原体污染的检测中，有着良好的特异性和敏感性，一次可以完成大量样品的检测。

  （5）电镜

  一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

  （6）定期检测

  支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

3、支原体污染的严重性

  （1）细胞外形可以没有明显的变化，支原体可以与细胞共存，污染后细胞液不会死亡，培养基一般不发生浑浊；

  （2）使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验的结果，因为支原体会抑制细胞生长；导致染色体畸变；细胞膜抗原性改变；细胞复苏后存活率降低等。

  （3）影响细胞的代谢和功能：培液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍；支原体活动使培液成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢。

  （4）培养过程中细胞破碎较多，培养基pH变化明显，需要频繁更换新鲜培养基；

  （5）细胞被支原体污染后会形成共生体系导致污染不断扩大。

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