微生物分离纯化方法
录入时间:2023-3-9 10:50:17
来源：青岛海博生物
常见的微生物分离纯化方法有稀释混合倒平板法、平板划线法、稀释涂布法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用，不需要特殊的仪器设备，分离纯化效果好。
平板划线法与稀释涂布平板法的区别
一、平板划线分离法
用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
用途：一般多用于菌种的纯化；
优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；
缺点：不能计数；
二、稀释涂布平板法：
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。
a. 样品稀释液的制备
（1）将分别盛有9mL无菌生理盐水的试管，进行编号。
（2）准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20s-30s，即成10-1稀释液；
（3）用移液枪吸取10-1稀释液1mL，移入装有9 mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；
（4）再吸取10-2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度；测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度；测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度；测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度
b.涂布操作：
(1) 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
(2) 取少量菌液（不超过0.1ml）滴加到培养基表面。
(3) 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s。
(4) 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。
注意：将涂布器末端浸在盛有体积分数为百分之七十的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
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