艰难梭菌的活化与保存

一、艰难梭菌简介

  艰难梭菌（Clostridium difficile）一般指艰难梭状芽孢杆菌，严格厌氧菌，对氧气极为敏感，暴露在空气中容易死亡，分离培养比较困难，因此起名为艰难梭菌。与产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、生孢梭菌同为梭状芽孢杆菌属，生长条件接近，可在硫乙醇酸盐流体培养基、庖肉培养基、血平板、哥伦比亚琼脂等培养基上生长（需严格厌氧培养），在紫外灯下有淡黄绿色荧光，不分解卵黄，不凝固牛奶。

二、活化方法

  1.硫乙醇酸盐流体培养基：此培养无需厌氧设备即可培养艰难梭菌，购买的艰难梭菌若为冻干粉形式，可用0.1%蛋白胨水溶解后，接种至硫乙醇酸盐流体培养基中36℃左右静置培养24-48h，可观察到艰难梭菌在氧化层以下生长。

  注：艰难梭菌在硫乙醇酸盐流体培养基中存活时间较短，观察到艰难梭菌活化成功后，应在24h内尽快传代或保存。

  2.庖肉培养基：配制时可在培养基表面覆盖约7mm厚的液体石蜡隔绝空气，灭菌后接种艰难梭菌，无需厌氧设备即可培养，36℃培养24-48h。

  3.血平板/哥伦比亚琼脂：将艰难梭菌的冻干粉溶解后涂布至血平板或哥伦比亚琼脂平板，迅速放入厌氧培养袋或厌氧培养箱中36℃培养24-48h，艰难梭菌呈淡黄色不规则菌落。

  注：艰难梭菌对氧气极为敏感，因此操作时应尽可能在厌氧操作中进行，若在空气中操作，应快速进行，接种后立即转入厌氧环境中培养基，减少氧气的毒害作用。

三、实验室保存及复苏方法

  长期保存：普通实验室可使用甘油法或脱脂牛奶进行超低温冷冻保存，将培养好的艰难梭菌转接至液体菌种保存管或脱脂牛奶菌种保存管中（尽可能挑取较多菌苔），用移液枪吹打分散均匀，置-80℃超低温冰箱或液氮罐中冷冻保存，至少可存活两年以上。复苏时，取出菌种保存管，快速解冻，将菌液加入至硫乙醇酸盐流体培养基/庖肉培养基或涂布至血平板/哥伦比亚琼脂平板36℃厌氧培养24-48h。

  短期保存：将艰难梭菌活化至庖肉培养基中，置于2-8℃冰箱中冷藏保存，艰难梭菌可存活数月，活化时吸取少量菌液转接至硫乙醇酸盐流体培养基/庖肉培养基或涂布至血平板/哥伦比亚琼脂平板36℃厌氧培养24-48h。

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