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洋葱伯克霍尔德菌群检查法草案公示稿

录入时间:2022-11-30 15:52:29 来源：国家药典委员会公示稿

洋葱伯克霍尔德菌群检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在洋葱伯克霍尔德菌群（Burkholderia cepaciacomplex，Bcc）。

当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否含有洋葱伯克霍尔德菌群时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。

供试品检出洋葱伯克霍尔德菌群或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。

供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则 1105）”。

如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。

供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。

培养基适用性检查和检查方法适用性试验

本检查中所使用的培养基应进行适用性检查。

检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的检查。

若检验程序或供试品发生变化可能影响检验结果时，检查方法应重新进行适用性试验。

菌种及菌液制备

菌种

试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）〔CMCC（B）23 005〕

新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）〔CMCC（B）23 006〕

神秘伯克霍尔德菌（Burkholderia aenigmatica）〔CMCC（B）23 010〕

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10 104〕

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26 003〕

菌液制备

将洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌、神秘伯克霍尔德菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养 18~24 小时，将培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在 2~8℃，可在24小时内使用。

阴性对照

确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

培养基适用性检查

本检查用的商品化的预制培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。

检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查，检查项目及所用菌株见表1。

表 1 培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性

培养基

特性

试验菌株

洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基

促生长能力+指示特性

抑制能力

洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌和神秘伯克霍尔德菌

铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌

培养基促生长能力检查

用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，各菌株在被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征均应一致。

培养基抑制能力检查

接种不少于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基中，在检查规定的培养温度及不小于规定的最长培养时间下培养，各试验菌均应不得生长。

培养基指示特性检查

用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在检查规定的培养温度及培养时间范围内培养，各菌株在被检培养基上生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等均应与对照培养基一致。

检查方法适用性试验

供试液制备

按下列“供试品检查”中的规定制备供试液。

试验菌

洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌和神秘伯克霍尔德菌。

适用性试验

按照供试品检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤后，注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。按照检查方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。

结果判断

各试验菌若在上述试验中均被检出，按此供试液制备方法和检查方法进行供试品检查；若未检出任一试验菌，应消除供试品的抑菌活性［见非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则 1105）中的“抗菌活性的去除与灭活”］，并重新进行方法适用性试验。

如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为洋葱伯克霍尔德菌群不易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。在此情况下，生产单位或研制单位应根据原辅料的微生物污染情况、生产工艺及产品特性进行产品的风险评估，以保证检验方法的可靠性，从而保证产品质量。

供试品检查

供试品的检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。

阳性对照试验

阳性对照试验方法同供试品的洋葱伯克霍尔德菌群检查，对照菌的加量应不大于100cfu。根据方法适用性试验结果，选择1株试验菌作为阳性对照菌株，阳性对照试验应检出相应的试验菌。

阴性对照试验

以稀释剂代替供试液照相应检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

供试液制备和??菌培养

除另有规定外，取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）”制成1:10供试液。取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基或适当稀释（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中（如：对制药用水进行检验时，可考虑用稀释10倍的胰酪大豆胨液体培养基进行??菌培养），混匀，30~35℃培养 48~72 小时。

选择和分离培养

取上述培养物划线接种至洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基平板上，30~35°C 培养 48~72 小时。

结果判断

若洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基上有菌落生长，如表现为表 2 中的生长特征等，应进行分离、纯化，并采用适宜的鉴定试验，确证是否为洋葱伯克霍尔德菌群；若洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基上没有菌落生长，或有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出洋葱伯克霍尔德菌群。

表 2 洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基上生长特征

培养基	生长特征
洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基	菌落呈灰白、灰粉色或土黄（棕）色，周围培养基由黄色变橘红或玫红色

稀释液

稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1．pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液照无菌检查法（通则 1101）制备。

2．pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.2无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液照缓冲液（通则 8004）配制后，过滤、分装，灭菌。

如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

3．0.9%无菌氯化钠溶液照非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则 1106）制备。

培养基及其制备方法

培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后，应按验证过的高压灭菌程序灭菌。

1．胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）照无菌检查法（通则1101）制备。

2．洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基

胰蛋白胨	10g	丙酮酸钠	7g
蔗糖	2g	氯化钠	5g
酵母提取物	1.5g	酚红	0.02g
庆大霉素	10mg	万古霉素	2.5mg
多粘菌素B	600000U	琼脂	14g
磷酸二氢钾	1.54g	结晶紫	0.001g
水	1000ml

除琼脂、庆大霉素、万古霉素、多粘菌素B外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 使灭菌后在 25°C 的 pH 值为 6.2±0.2，加入琼脂，加热融化后，摇匀，分装，灭菌。灭菌后，冷至 45~50℃，加入多粘菌素B、庆大霉素、万古霉素，混匀，倾注平皿。

附表洋葱伯克霍尔德菌群种水平成员

序号	名称	中文名称	备注
1	B.cepacia	洋葱伯克霍尔德菌	基因型I
2	B.multivorans	多噬（食）伯克霍尔德菌	基因型II
3	B.cenocepacia	新洋葱伯克霍尔德菌	基因型III
4	B.stabilis	稳定伯克霍尔德菌	基因型IV
5	B.vietnamiensis	越南伯克霍尔德菌	基因型V
6	B.dolosa	狡猾伯克霍尔德菌	基因型VI
7	B.ambifaria	双向伯克霍尔德菌	基因型VII
8	B.anthina	花园伯克霍尔德菌	基因型VIII
9	B.pyrrocinia	吡咯菌素伯克霍尔德菌	基因型IX
10	B.latens	隐蔽伯克霍尔德菌	/
11	B.diffusa	广布伯克霍尔德菌	/
12	B.arboris	森林伯克霍尔德菌	/
13	B.seminalis	种子伯克霍尔德菌	/
14	B.metallica	金属伯克霍尔德菌	/
15	B.ubonensis	乌汶伯克霍尔德菌	/
16	B.contaminans	污染伯克霍尔德菌	TaxonK
17	B.lata	普通伯克霍尔德菌	TaxonK
18	B.stagnalis	湖水伯克霍尔德菌	/
19	B.territorri	领土伯克霍尔德菌	/
20	B.pseudomultivorans	假多噬伯克霍尔德菌	/
21	B.catarinensis	圣卡塔琳娜伯克霍尔德菌	/
22	B.puraquae	纯水伯克霍尔德菌	/
23	B.paludis	沼泽伯克霍尔德菌	/
24	B.aenigmatica	神秘伯克霍尔德菌	TaxonK

注：数据统计截止 2021 年 6 月，将根据分类发展进行更新

起草单位：中国食品药品检定研究院联系电话：67095695

复核单位：天津市药品检验研究院、河北省医疗器械检验检验研究院、辽宁省药品检验检测院、上海市食品药品检验研究院、山东省食品药品检验研究院、河南省食品药品检验所、广东省药品检验所、苏州市药品检验检测研究中心、四平市食品药品检验所、淄博市食品药品检验研究

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