罗氏培养基斜面管制备方法及注意事项

一、用途及原理

  罗氏培养基常用于培养分枝杆菌，特别是用于结核分枝杆菌的分离培养及卡介苗的传代和保存。结核分枝杆菌为专性需氧菌，营养要求较高，能耐酸，最适生长pH为6.5-6.8，生长缓慢，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油及某些无机盐类的特殊培养基上才能生长。罗氏培养基中的全蛋液营养丰富，可促进分枝杆菌快速生长，培养基中的孔雀绿可抑制部分杂菌的生长。

二、培养基配方

  注：由痰等标本中分离分枝杆菌时，若前处理方法为碱性物质，可将培养基中的磷酸二氢钾由2.4g增加至14g，即可制成酸性罗氏培养基；若前处理方法为酸性物质，可将培养基中的2.4g磷酸二氢钾改为3.6g磷酸氢二钾，即可制成碱性罗氏培养基。

三、配制方法

  （1）基础培养基：称取除全蛋液以外的成分加热煮沸溶解于600mL纯化水中，加热过程需不停搅拌以防止马铃薯粉凝成块或糊底，121℃灭菌15min，冷却至55℃备用；

  （2）全蛋液制备：将新鲜鸡蛋洗刷外壳后，浸于5%碳酸钠溶液中约30min，用清水冲洗后，浸泡于75%乙醇溶液中数分钟，在无菌环境中用灭菌的镊子或其他器具打破蛋壳，将蛋液倒入含玻璃珠的无菌锥形瓶中（可预先将玻璃珠放入锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15-30min），充分摇晃使蛋黄、蛋白摇散混合均匀。

  注：新鲜鸡蛋内的蛋液通常是无菌的，无须进行灭菌处理，操作过程应注意避免污染。若蛋液中可能残存蛋壳碎渣，可将打散后的全蛋液用无菌纱布进行过滤。

  （3）将1000mL全蛋液与600mL基础溶液混合充分摇匀，无菌分装于灭菌的试管中，每管5-7mL（视试管的大小调整装量），摆长斜面，用85-90℃流动蒸汽灭菌1-1.5h至斜面完全凝固，取出冷却后备用。制备好的罗氏培养基斜面应呈微绿色或黄绿色。

  注：不同于一般的培养基，此培养基中不使用琼脂，而是通过蛋液的凝固效果制成固体培养基，因此硬度较低，且分枝杆菌生长周期长，为防止培养基过分失水变干，通常使用试管制成斜面使用而不是做成平板（平板通常培养3-5天后会有明显失水变薄现象，而分枝杆菌通常需要培养数周的时间）。将蛋液与基础培养基混合时，应缓慢倒入轻轻摇匀，防止产生过多气泡。85-90℃的流动蒸汽可以保持蛋液中的维生素不被破坏，也可使用凝固器加温至85-90℃，若无流动蒸汽灭菌器和凝固器，也可使用烘箱调节至85-90℃使培养基凝固。

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