空肠弯曲菌检验方法及结果判断

一、空肠弯曲菌简介

  空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是弯曲菌属中的一个亚种，是引起急性腹泻的重要病原菌，许多国家报道，本菌从腹泻病例的分离率为5%～14%，从无症状人群的粪便标本中分离率小于1%，目前已证明为人畜共患病菌。

  本菌为革兰氏阴性菌，多形态，螺旋性，弯曲杆状，有一个以上的螺旋并可长达8μm，也可出现S形或似飞翔的海鸥形；菌体一端或两端有单根鞭毛，长度约为菌体的2～3倍，有活泼的动力或不产生动力；超过48h的培养物以衰老的球菌状居多。

  本菌属于微需氧菌，初次分离时需在含5%氧、85%氮和10%二氧化碳环境中，传代后能在10%二氧化碳环境中生长，在多氧和绝对无氧的环境中均不生长。培养适宜温度为25℃～43℃，培养最适温度为42℃，最适pH值7.2。对糖类既不发酵也不氧化，呼吸代谢无酸性或中性产物，生长不需血清，从氨基酸或三酸循环获得能量。

在布氏肉汤中生长呈均匀浑浊。在血琼脂上，初次分离出现两种菌落特征：第一型菌落不溶血、灰色、扁平、湿润、有光泽，看上去像水滴，边缘不规则，常沿划线蔓延生长；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落（直径1nm～2nm）边缘整齐、半透明、有光泽、中心稍浑，呈单个菌落生长。

  在国内外标准（包括美国FDA、ISO、GB等标准）中，食品中空肠弯曲菌的检验通常是用Bolton肉汤进行选择性增菌培养，然后利用改良CCD琼脂和Skirrow血琼脂进行选择性分离，最后进行生化鉴定。

二、参考标准

  《GB 4789.9-2014食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》点击下载

三、检验程序

  空肠弯曲菌检验程序见图1。

图1 空肠弯曲菌检验程序

四、检验方法及结果判断

  4.1 样品处理

  4.1.1 一般样品

  取25g（mL）样品（水果、蔬菜、水产品为50g）加入盛有225mL的Bolton肉汤的有滤网的均质袋中（若为无滤网均质袋可使用无菌纱布过滤），用拍击式均质器均质1min～2min，经滤网或无菌纱布过滤，将滤过液进行培养。

  4.1.2 整禽等样品

  用200mL的0.1%的蛋白胨水中充分冲洗样品的内外部，并振荡2min～3min，经无菌纱布过滤至250mL离心管中，16000g离心15min后弃去上清，用10mL的0.1%蛋白胨水悬浮沉淀，吸取3mL于100mL的Bolton肉汤中进行培养。

  4.1.3 贝类

  取至少12个带壳样品，除去外壳后将所有内容物放到均质袋中，用拍击式均质器均质1min～2min，取25g样品至225mL的Bolton肉汤中（1:10稀释），充分震荡后再转移25mL于225mL的Bolton肉汤中（1:100稀释），将1:10和1:100稀释的Bolton肉汤同时进行培养。

  4.1.4 蛋黄液或蛋浆

  取25g（mL）样品于125mL的Bolton肉汤中并混匀（1:6稀释），再转移25mL于100mL的Bolton肉汤中并混匀（1:30稀释），同时将1:6和1:30稀释的Bolton肉汤进行培养。

  4.1.5 鲜乳、冰淇淋、奶酪等

  若为液体乳制品取50g；若为固体乳制品取50g加入盛有50mL的0.1%蛋白胨水的有滤网均质袋中，用拍击式均质器均质15s～30s，保留过滤液。必要时调整pH值至7.5±0.2，将液体乳制品或滤过液以20000g离心30min后弃去上清，用10mL的Bolton肉汤悬浮沉淀（尽量避免带入油层），再转移至90mL的Bolton肉汤进行培养。

  4.1.6 需表面涂拭检测的样品

  无菌棉签擦拭检测样品的表面（面积至少100cm²以上），将棉签头剪落到100mL的Bolton肉汤中进行培养。

  4.1.7 水样

  将4L的水（对于氯处理的水，在过滤前每升水中加入5mL 1mol/L硫代硫酸钠溶液）经0.45μm滤膜过滤，把滤膜浸没在100mL的Bolton肉汤中进行培养。

  4.2 预增菌与增菌

  在微需氧条件下，36℃±1℃培养4h，如条件允许配以100r/min的速度进行振荡。必要时测定增菌液的pH值并调整至7.4±0.2，42℃±1℃继续培养24h～48h。培养结果如图2所示。

  Bolton肉汤原理：乳白蛋白水解物、动物组织酶解物提供碳、氮源；酵母浸膏提供各种维生素；氯化钠维持均衡的渗透压；丙酮酸钠和偏亚硫酸氢钠能中和培养基的有毒物质，也能增强培养基的空气耐受力；α-酮戊二酸提供生长因子，促进空肠弯曲菌的生长；碳酸钠提供空肠弯曲菌最有利的酸碱环境；头孢哌酮和多粘菌素B抑制革兰氏阴性菌的生长；万古霉素和三甲氧苄嘧啶抑制革兰氏阳性菌的生长；两性霉素B抑制酵母和真菌的生长。

  Bolton肉汤用法：称取基础培养基27.6g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。待Bolton肉汤基础冷却至45℃左右，在无菌条件下，每100mL基础培养基加入5mL无菌裂解脱纤维羊或马血和1支Bolton肉汤添加剂，混匀，备用。

  注：培养基高压灭菌后有一些小黑色颗粒。

图2 Bolton肉汤增菌培养结果

  4.3 分离

  将24h增菌液、48h增菌液及对应的1:50稀释液分别划线接种于Skirrow血琼脂与mCCDA平板上，微需氧条件下42℃±1℃培养24h～48h。培养结果分别如图4、图3所示。另外可选择使用空肠弯曲菌显色平板作为补充。

  观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态，mCCDA平板上的可疑菌落通常为淡灰色，有金属光泽、潮湿、扁平，呈扩散生长的倾向。Skirrow血琼脂平板上的第一型可疑菌落为灰色、扁平、湿润有光泽，呈沿接种线向外扩散的倾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落，边缘整齐、发亮。

  空肠弯曲菌显色培养基上的可疑菌落按照说明进行判定。

  mCCDA原理：肉浸液、动物组织酶解物、酪蛋白酶解物提供碳、氮源，维生素，生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；木炭具有解毒、收集二氧化碳和改变表面张力的作用；去氧胆酸钠为选择性抑菌剂；头孢哌酮可抑制普通肠道菌生长，两性霉素B抑制酵母和真菌生长，利福平可抑制非弯曲菌其他厌氧菌的生长。硫酸亚铁和丙酮酸钠有利于空肠弯曲菌的生长；琼脂是培养基的凝固剂。

  mCCDA用法：称取本品51.5g，加入1L蒸馏水或去离子水中，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，每瓶200mL，121℃高压灭菌15min。待基础培养基的冷却至45℃左右时，加入1支改良CCD琼脂添加剂（含头孢哌酮6.4mg、两性霉素B2mg和利福平2mg），混匀，倾入无菌平皿，备用。

空肠弯曲菌 CICC 22936	空肠弯曲菌 ATCC 33291

  Skirrow琼脂原理：蛋白陈、胰蛋白陈、酵母浸膏提供碳、氮源，维生素，生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；丙酮酸钠、焦亚硫酸钠、硫酸亚铁有利于弯曲菌的生长。头孢哌酮可抑制革兰氏阴性细菌和部分革兰氏阳性菌的生长；两性霉素B抑制真菌生长；利福平可抑制非弯曲菌其他厌氧菌；琼脂是培养基的凝固剂。

  Skirrow用法：称取基础培养基42.5g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，每瓶100mL，121℃高压灭菌15min。待基础培养基的冷却至45℃左右时，加入1mL过滤除菌的FBP溶液、1支改良Skirrow氏琼脂基础添加剂和无菌冻溶脱纤维羊血5mL，混匀，倾入无菌平皿。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4天或在4℃左右冷藏不得超过7天。

空肠弯曲菌 CICC 22936	空肠弯曲菌 ATCC 33291

图4 Skirrow琼脂培养结果

  4.4 鉴定

  4.4.1 弯曲菌属的鉴定

  4.4.1.1 概述

  挑取5个（如少于5个则全部挑取）或更多的可疑菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板上，微需氧条件下42℃±1℃培养24h～48h，生长情况如图5所示。

空肠弯曲菌 CICC 22936	空肠弯曲菌 ATCC 33291

图5 哥伦比亚血琼脂平板微需氧条件下42℃±1℃培养结果

  按照4.4.1.1～4.4.1.5进行鉴定，结果符合表1的可疑菌落确定为弯曲菌属。

表1 弯曲菌属的鉴定

  4.4.1.2 形态观察

  挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。结果如图6所示。

图6 革兰氏染色镜检结果

  4.4.1.3 动力观察

  挑取可疑菌落用1mL布氏肉汤悬浮，用相差显微镜观察运动状态。

  4.4.1.4 氧化酶试验

  用铂/铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。结果如图7所示。

图7 氧化酶试验结果

  4.4.1.5 微需氧条件下25℃±1℃生长试验

  挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，微需氧条件下25℃±1℃培养44h±4h，观察细菌生长情况。空肠弯曲菌在该培养条件下不生长，培养结果如图8所示。

空肠弯曲菌 CICC 22936	空肠弯曲菌 ATCC 33291

  4.4.1.6 有氧条件下42℃±1℃生长试验

  挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，有氧条件下42℃±1℃培养44h±4h，观察细菌生长情况。空肠弯曲菌在该培养条件下不生长，培养结果如图9所示。

空肠弯曲菌 CICC 22936	空肠弯曲菌 ATCC 33291

图9 哥伦比亚血琼脂平板有氧条件下42℃±1℃培养结果

  4.4.2 空肠弯曲菌的鉴定

  4.4.2.1 过氧化氢酶试验

  挑取菌落，加到干净玻片上的3%过氧化氢溶液中，如果在30s内出现气泡则判定结果为阳性。结果如图10所示。

大肠埃希氏菌 ATCC 25922	空肠弯曲菌 ATCC 33291

图10 过氧化氢酶试验结果

  4.4.2.2 马尿酸钠水解试验

  挑取菌落，加到盛有0.4mL的1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在36℃±1℃水浴中温育2h或36℃±1℃培养箱中温育4h。沿着试管壁缓缓加入0.2mL的茚三酮溶液，不要振荡，在36℃±1℃的水浴或培养箱中再温育10min后判读结果。若出现深紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。结果如图11所示。

图11 马尿酸钠水解试验结果

  4.4.2.3 吲哚乙酸酯水解试验

  挑取菌落至吲哚乙酸酯纸片上，再滴加一滴灭菌水。如果吲哚乙酸酯水解，则在5min～10min内出现深蓝色；若无颜色变化则表示没有发生水解。不同细菌在吲哚醋酸酯纸片上的生化反应现象如图12所示。

图12 吲哚乙酸酯水解试验结果

  空肠弯曲菌的鉴定结果见表2。

表2 空肠弯曲菌的鉴定特征

  4.4.2.4 替代试验

  对于确定为弯曲菌属的菌落，可使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡代替4.4.2.1~4.4.2.3进行鉴定。

  4.5 结果报告

  综合以上试验结果，报告检样单位中检出或未检出空肠弯曲菌。

相关标准：

GB 4789.9-2014 空肠弯曲菌检验 点击下载

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

上一篇：水质粪大肠菌群的测定滤膜法及结果分析

下一篇：蜡样芽孢杆菌检验方法及结果判断