致敏红细胞

【原理】

  间接红细胞凝集（简称间接血凝）试验是以红细胞为抗原或抗体的载体，根据抗原和抗体的特异性反应，用已知抗原测定未知抗体或用已知抗体测定未知抗原的一种微量、快速、敏感的血清学方法。

  根据致敏用抗原或抗体的不同和参加反应成分的不同，间接血凝可分为以下3种。

  （一）间接血凝试验

  将细菌多糖质或各种蛋白质抗原吸附在红细胞表面上，该红细胞称为抗原致敏红细胞，这种抗原致敏的红细胞就具备了一种新的血清学性质，当与相应的抗血清相遇时，在适宜条件下，抗原就和抗体结合起来，因此红细胞也被动地凝集起来。

  （二）反向间接血凝试验

  将抗体致敏在红细胞上，以测定相应的抗原。

  （三）间接血凝抑制试验

  这一方法多是利用抗原致敏的红细胞来测定可溶性抗原。其基本原理是将待测的可溶性抗原液中加入已知的抗体，待反应后，再加入抗原致敏的红细胞，由于加入的抗体和待测抗原已先行结合，所以抗原致敏红细胞的凝集被抑制。

【成分】

【制法】

  1.醛化红细胞：

  (1）红细胞：多种动物的红细胞均可用于间接血凝试验。一般多用绵羊和人“O”型红细胞。我们认为绵羊红细胞在多方面是满意的，例如绵羊红细胞容易大量获得，不同批次致敏的红细胞，波动范围较小，血凝模式也比较稳定。

  (2）脱纤维血的制备：目前多用阿氏保存液来抗凝和保存红细胞，方法是以无菌手续采集绵羊血或其他动物血液，按1:3（全血：保存液）的比例置于保存液中，立即充分摇动5~8分钟，以防止发生凝块，保存在4℃冰箱备用。

  (3）沉积红细胞体积的测量：

   ①取薄层脱脂棉铺于玻璃漏斗中。

   ②将保存液中的血液，通过上述漏斗，过滤在其他容器中以除去可能凝结的血块，记下滤液的总量。

   ③将过滤的血液混均，取10ml置于刻度离心管中，3000rpm30分钟，轻轻取出离心管，沉积的红细胞呈水平液面（水平转头离心），读取红细胞高度，从总量算出压积红细胞的总体积。

  (4）醛化红细胞：新鲜红细胞经醛类固定以后，可大大延长可用期。常用的醛类有甲醛、戊二醛及丙酮醛。不同醛类固定的红细胞经致敏后，血凝反应的敏感性是不同的。双醛化的红细胞可提高血凝反应的敏感性。现仅例举戊二醛固定法。

  戊二醛固定法：

   ①将绵羊或人“O”型红细胞用0.15molpH7.2磷酸盐缓冲液洗5次。

   ②把洗过的细胞和1％戊二醛溶液预先放在冰浴中，使冷却到6~8℃。

   ③按沉积红细胞10ml加入1％戊二醛溶液100ml计算，在冰浴中将1％戊二醛溶液加到洗过的红细胞中，边加边摇，在冰浴中醛化45分钟。

   ④将醛化的红细胞用生理盐水洗5次，然后配成10％醛化红细胞，放普通冰箱备用。

  (5）醛化红细胞的性质：

   ①醛化后的红细胞，镜检一般呈两面凸起的圆盘状，有的呈轻度变形。大部呈散在状态，也有的数个细胞堆在一起。

   ②醛化的红细胞总体积有不同程度的增加，一般约増加10%~20%，体积增加的程度取决于醛化过程中红细胞的破坏程度和洗涤时损失的多少而定。叠氮钠可使醛化的红细胞颜色变红。

   ③醛化红细胞抵抗低渗溶解和机械振荡的能力甚强，反复冻融和在蒸馏水中皆不溶血，加温60℃亦不被破环。冻干后重新悬浮，无明显变化。

   ④醛化的红细胞，不妨碍红细胞表面化学基团对抗原或抗体的吸附。

  2.致敏方法：自Boyden (1951）用鞣酸处理红细胞将蛋白质抗原致敏在红细胞上以后，又研究出来多种新的致敏方法，这些方法各有其特点。今将我们常用的铬-鞣酸法介绍如下。

  铬-鞣酸法致敏红细胞：

  (1)取10％醛化红细胞0.3ml置于刻度离心管中，用4ml生理盐水洗两次，去上清；

  (2)加2ml用0.075molpH5.0醋酸缓冲液稀释的抗体（0.05~1mg/ml)，混均，再加用生理盐水稀释的三氯化铬（10~20μg/ml)2ml，混均，再加生理盐水稀释的1:20000鞣酸2ml，混均；

  (3)于37℃水浴中致敏10分钟，此期间混均两次；

  (4)离心去上清，用1%NRS洗两次；

  (5)最后加4ml1%NRS,配成0.75％致敏红细胞备用。

【用途】

  间接血凝技术，由于具有快速、敏感和简便的优点，已成为广泛应用的血清学方法之一，它不但是研究传染病、寄生虫病的病原学、免疫学和流行病学的良好手段，而且亦用于血液病病因、自家免疫病、过敏性疾病以及生长激素的研究。

【注意事项】

  1．致敏用蛋白质抗原或抗体的纯度对血凝效果的好坏至关重要。如果抗原或抗体不纯，杂蛋白可明显地影响致敏效果，纯度高、蛋白量少、效价高的抗体可获得血凝效价高和稳定性好的抗体血球。

  2．致敏用抗原或抗体的理化性质。蛋白质抗原和抗体由于其本身固有的性质不同，致敏红细胞的效果也不同，有的经纯化后不经任何处理，即可获得良好的致敏效果，而另外一些蛋日质抗原和抗体需使之发生轻度变性，才具有较好的致敏效果。

  3．用鞣酸方法致敏时，鞣酸浓度须合适，一般常用的浓度对1:20000。红细胞经鞣酸处理后变为不稳定，而用1％正常兔血清盐水来稳定鞣化的红细胞，可得到较好效果。

  4．致敏的抗原或抗体浓度与血凝反应的敏感性和特异性明显关系。合适量的致敏用抗原或抗体需先滴定。

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