培养基不能正常凝固的原因及解决办法

  琼脂具有特殊的溶点和凝固点，所含成分很难被微生物分解利用且不含抑制性成分，因此很适用于微生物培养基的制备，从而作为固体培养基最常用的凝固剂，到目前为止，在这方面世界上还没有一种能够完全替代琼脂的代用品。

  一些初期从事植物组织培养工作或微生物培养的人员，尤其是初学者，在配制培养基时往往会遇到培养基难以正常凝固的现象：或呈半流体、或完全呈液体状态、同时还会现出各种颜色。本文将对琼脂的凝固性以及影响其凝固性的关键因素作系统的介绍，并针对不同的操作方法进行问答式评价，以期能帮助更多的人解决实际工作中的相关问题，少走弯路。

一、有关琼脂的知识

  琼脂，又名琼胶或冻粉，因最初从日本海藻中提取，故又称“洋菜”。琼脂成品为白色或淡黄色粉末状或细条形，主要是由复杂的大分子多糖类物质组成。其水解物的组成有40%的D-半乳糖、3%硫酸酯和2%丙酮酸，实际上，它是琼脂胶和琼脂糖两种成分的混合物。琼脂胶是琼脂糖的硫酸酯，琼脂糖主要依靠氢键的引力形成网状结构。因此，琼脂糖凝胶的稳定性比那些以化学键交联而形成网状结构的凝固剂的稳定性要差一些。

  琼脂溶于热水而不溶于冷水，因此在配制培养基时需煮制琼脂。随着温度的升高，琼脂逐渐溶解，当温度下降到40℃时则开始凝固。配制培养基时应注意，由于各地生产的琼脂的质量不同，同样浓度的琼脂水溶液凝固后在硬度、透明度及色泽上会有所差异。劣质琼脂不仅凝固性差，而且带有很多杂质。

二、有关琼脂凝固性的知识

  作为培养基的凝固剂，琼脂的凝固性除与琼脂本身的品质有关外，还会受到灭菌温度、灭菌时间、琼脂量和pH值的影响。

  （1）0.7%～0.8%的琼脂水溶液在冷却后会很好凝固，对于常用的微生物培养基，琼脂的用量基本趋于稳定，通常条状琼脂的用量约为2%，粉状琼脂的用量为1%～1.5%。

  （2）培养基的酸碱度对琼脂的凝固性影响很大，是琼脂在正常浓度范围内能否凝固的关键因素，当4.30

  （3）在4.30²，120℃)的影响很小，延长高温高压灭菌时间或反复高温高压处理均不会影响其凝固性。pH较高(5.0-8.0)时，琼脂浓度是影响凝固等级的主要因素。

  （4）当配制的固体培养基pH低于3.44时，其凝固性会受到灭菌温度、灭菌时间、琼脂量和pH值的影响。其中灭菌温度、灭菌时间与琼脂凝固性呈负相关，琼脂量、pH值与琼脂凝固性呈正相关。但在这些因素中，琼脂量的影响不是很大，因此在该类培养基的灭菌过程中应该重点把握好灭菌温度、灭菌时间和pH值。使用较低的灭菌温度，较短的灭菌时间，适当地增加培养基的pH值就可以显著提高琼脂的凝固性。pH较低(≤4.0)时，pH是影响凝固等级的主要因素。

三、案例分析

  基于实验得出的理论知识，大家都比较好理解和接受，但在实际操作过程中，经常会有人碰到琼脂不能凝固的情况（如图1），下面针对具体案例进行分析讨论：

图1 灭菌后的培养基出现分层现象

案例一

  问：我使用的是**生产的琼脂，用冷水就能溶解了，高压蒸汽灭菌后就能使用了，最近在倒平板时，发现有几块怎么也不凝固，同一瓶子里的琼脂只有几块不凝固，我专门放到第2天发现还是稀呼呼的。

  答：首先纠正一下，您说用冷水就能溶解了，这肯定不对：琼脂溶于热水而不溶于冷水，将琼脂放在冷水中，充其量只能是把琼脂浸湿了泡软了，根本达不到溶解的程度，也就谈不上均匀地分散在培养基溶液中了。既然分散不均匀，灭菌后倒出的平板，就容易产生琼脂含量不一的结果，表现出来的现象就是您所描述的，同一瓶子里的琼脂，有几块怎么也不凝固，即使放到第2天或更多天，也不会凝固，因为里面的琼脂含量很少啊，达不到凝固的要求，即使放再多时间结果也是一样。

  问：必须要完全煮化吗？

  答：琼脂必须煮沸，常温下是溶解不了的，只有煮沸后再冷却才会凝固。

  问：夏天温度高的时候是不是就不用煮沸了？

  答：配好培养基后，一定要加热搅拌溶解。培养基外包装标签上说得很清楚，要加热煮沸至完全溶解，夏天温度再高也不会超过50度吧？所以天气热了也要这么做，使得培养基中各成分混合均匀。步骤不要省略！！！

  问：那我们以前都是同样的操作，怎么都好着呢？

  答：正确的培养基配制方法应该是先将含琼脂培养基煮沸至完全溶解之后，再分装入三角瓶中进行灭菌，并且灭菌完毕从锅里拿出来后，要及时摇一摇三角瓶（用力摇），使灭菌后的培养基中琼脂能够均匀分散在里面，然后再倾倒平皿。你之前没出问题，不代表你的操作就是合乎要求的，你不按照正规的方法操作，迟早会出问题的，这不就被你碰到了吗？

  另外，即使灭菌前没有先煮沸再分装灭菌，只在灭菌完毕，开锅后第一时间将瓶内培养基摇匀，也就不会出现你碰到的问题了。

  这里需要注意，摇匀，一定是用力摇匀，而不是随手轻轻一晃就行了。

  问：为何还要摇啊？你在煮沸、灭菌时，不就自然匀了吗？

  答：灭菌时能自然匀了？这也是你自己认为的吧？当然很多人都会这么认为。熬粥的时候满锅里都沸腾，稍放置一会儿，锅底的粥是不是要稠一些？大同小异！

  问：可是灭菌后摇晃容易产生气泡啊？

  答：开锅拿出来后手摇几下就匀了，少量气泡稍微静置就会消掉的，或者放到水浴锅里恒温到50度的时候一般就没有气泡了。临倒平板前就不要摇了！那时候再摇，气泡可能就不容易消掉了。

  问：那我怎么摇匀？我用500mL的三角瓶配500mL培养基，根本摇不起来！

  答：问题就出来这里，做微生物实验，将配好的培养基分装到适当容器中，培养基体积不应超过容器容积的2/3(可参考GB 4789.28食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求)。也就是说不要将瓶子里装得满满当当的，这样很容易导致琼脂沉在下面，不容易摇匀。

  我们平时做实验，配500mL培养基用1000mL的瓶子，配200mL培养基用500mL瓶子，500mL的瓶子里最多装400mL培养基的，你比较看看你的装量。

  问：我们一直都这么配制的，只是最近的出了问题，同一瓶培养基，只有几个板这样的。

  答：培养基的标签上有明确的用法：称23.5 g于1 L蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，121摄氏度灭菌15分钟，冷却至46摄氏度左右备用。

  对比上面的解答，看看你们一直以来的操作有哪些问题吧，然后按照正规的操作要求再坚持一段时间，再出现同样的问题再来找我好吧？(不摇匀的情况下，同一瓶培养基倒出的平板强度差异很大，可参考附录表格)。

案例二

  问：配制的是营养琼脂培养基，都是按照上面说的配制的，灭菌后放入冰箱怎么也不能完全凝固，在底部还有非常硬的像胶皮一样的胨。请帮忙看看到底是怎么回事。

  答：有没有想过最底部的非常硬的胶皮一样的东西是什么？那就是相对很浓的琼脂液冷却形成的。如果把这一部分琼脂趁热摇匀，使其均匀分散在整瓶培养基里面呢？是不是上面就没那么稀了，能凝固了，下面也没那么稠了，硬度合适了。也就是说摇匀后倒平皿，整瓶培养基都能用了。

  你灭菌后没经过摇匀，琼脂本来就沉积在瓶底，直接放入冰箱，瓶底迅速冷却，大量的琼脂就先凝固了，瓶子上面的部分含琼脂就很少了，所以才会不凝固。不管放多久都不会改善啊！

  问：听说琼脂太酸也不会凝固，是不是我们使用的培养基pH不合格啊？

  答：pH合格不合格，你测一下不就知道了。在pH 5-10之间，pH对琼脂的凝固性影响并没有那么大。你用的都是常规培养基，pH怎么可能那么低嘛。另外，如果是pH值太低的话，加热以后琼脂会变性，底部就不会有凝固的琼脂硬块了，而会成一瓶糊糊。你这显然是琼脂混合不均匀引起的，使用前用微波溶化，晃一晃就好了。

  问：用两个大烧杯把融化了的培养基来回倾倒混匀，然后倒皿，效果不错。

  答：道理是一样的，就是为了使琼脂混合均匀。但这种操作方法有点繁琐，并且容易染菌，不提倡。

  问：像我这种情况，培养基还能用吗？

  答：能用！重新水浴加热，让其完全溶解后，摇匀，倾倒平板即可。或者用微波加热，要注意随时观察，经常拿出来摇一摇，以免培养基喷出。

  问：培养基可以多次这样反复融化使用吗？

  答：不建议！如果不是不得已，建议现灭现用。

案例三

  问：今天分别用了伊红美蓝琼脂和营养琼脂两种培养基做斜面，然而灭菌后做斜面都不凝固，这是为啥？有的凝固也就是一半凝。

  我的步骤：如营养琼脂，按配比称3.3g加100mL水，加热搅拌溶解，分装到试管中后加棉花塞，包扎后于121℃灭菌锅中灭菌20分钟，好了之后制作斜面，等了有半小时久，培养基都不凝固这是为何？

  答：你先要煮沸溶解培养基，搅拌均匀，稍冷后（50℃）尽快分装，琼脂的在水中需加热至95℃时才开始熔化，你只是加热搅拌溶解，琼脂是不是真正溶解透了有待考证。

  试管灭菌完毕，拿出来晃一晃再摆斜面，否则容易上层稀不凝固，下层浓很容易凝固。跟三角瓶灭培养基是一样的道理。

  问：我煮了还是没很凝固这是为什么？

  答：先加热煮沸，直至白色泡沫上升，然后再分装、高温高压灭菌。

  问：白色泡沫上升好危险，我试过被琼脂沸腾连塞子喷我一脸！

  答：我们通常都是用搪瓷缸，最多装液量1/3，煮沸三次，彻底煮透、溶透。

  问：溶解后用吸量管分装，在吸量管中就凝固了，要怎么分装？量筒吗？

  答：我们都是用10 mL或5 mL移液枪分装的，再把分装试管塞好灭菌。

  煮沸溶解分装然后灭菌制斜面成功了！再次提醒，灭菌后，温度没降下来前一定要摇一摇，不管瓶装还是试管装，都要摇匀！！

案例四

  问：琼脂培养基制作斜面为什么无法完全凝固，而做培养皿时完全凝固？

  答：琼脂混合不均匀。相比三角瓶，试管的空间更加狭小，开锅后一定要趁热晃一晃，使底部沉积的琼脂完全混匀。否则就容易导致试管底部凝固，而上部不凝固或凝固不好的问题。

案例五

  问：微生物检验用的营养琼脂培养基，可以第二次高压灭菌么?有何影响，如果加热培养基使其溶化后，不一会儿就会凝，而如果用高压灭菌就不会很快凝固，所以想再用高压湿热灭菌，加热使其溶化，可否?

  答：二次高压湿热灭菌，会导致营养成分的损失。所以，最好是通过水浴加热，温度维持在100度，琼脂就可完全化开，冷却至50度左右，就可进行倒板等操作了。

  问：培养基能加热几次?营养琼脂和玫瑰红钠配置好了以后，我是保藏在冰箱里的，同一瓶最多能水浴几次使用呢?

  答：在保证不染菌的情况下是可以多次使用的。琼脂的溶解温度是95度，若水浴的话时间来得及可以是沸水浴。若是时间紧迫可直接放在电炉上熔化，但要一直盯着，防止沸出来。如果是已经灭好菌的玻璃器皿，可以用微波炉加热，不过要注意观察，防止沸腾出来。一般从冰箱里拿出来就用一次，不提倡反复融化。

  问：有人说加热时间过长，也会导致琼脂不凝固，是这样吗？

  答：是的。通常来说，灭完菌就要及时开锅取出培养基。如果因为其他原因，耽误了，稍有延长也不大要紧，这里所说的加热时间过长，是指高压超过半小时或者灭菌后一直放在灭菌锅内很长时间甚至过夜的情况。这些都是错误的操作，即使培养基能凝固，里面的营养成分也发生了很大的变化，对实验结果的判断造成很大影响。应该杜绝类似的操作。

  通过上述几个案例的分析，我们可以总结一下。遇到固体培养基不凝固的情况，通常首先考虑一下几点：

  （1）琼脂少，特别是自己配制培养基时，可能根本就漏加琼脂了；

  （2）pH值不对，实验室用水PH过低，且配制完没能调整pH，或者本身就是酸度很大的培养基；

  （3）反复加热；

  （4）加热时间过长；

  （5）灭菌前是否煮沸溶透，灭菌后是否摇匀。

  结合自己的实际操作，一项一项排除查找原因。这里面，最简单也最容易被忽视的就是灭菌后摇匀的问题。

  本实验室试验对比发现，倾倒平皿前摇匀与不摇匀，所形成的平板强度差异很大，如果不经摇匀直接倾倒，形成的平板有约有2/3凝胶强度过低，不能满足试验要求，而最后倒出的几块平板强度会急剧升高，硬度过大，也影响使用；而摇匀后再倾注的平板，凝胶强度数值分布比较均匀，满足试验要求（表1，图2）。经常听到有人说，平常一直那么做（不煮沸，不摇匀），都没问题，实际上那样倒出来的平板只是都凝固了而已，即使能用，平板间凝胶强度的差异也是很大的。

  希望大家在实际操作中一定注意，严格按照说明书的要求进行操作。

附图表：

表1 用相同方法配制的等量培养基开锅后摇匀与不摇匀倾倒成的平板强度

图2 倾倒平板前培养基摇匀和不摇匀所倾注的平板强度规律

相关标准：

GB 4789.28-2013 培养基和试剂的质量要求 点击下载

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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