口腔支原体固体平板培养法及染色镜检观察

一、支原体简单介绍

  1.形态特征

  支原体是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为0.1-0.3微米。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。

  2.生化分型

  常利用发酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反应鉴别支原体。 一般能分解葡萄糖的支原体则不能利用精氨酸，如肺炎支原体；能利用精氨酸的支原体则不能分解葡萄糖，如口腔支原体、人型支原体；解脲支原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。

  3.培养特性

  支原体对营养需求较高，一般需要在培养基中添加一定比例的动物血清，大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5%CO₂生长更好。支原体生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上培养会出现典型的“荷包蛋样”，核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。

  4.抵抗力

  支原体对热的抵抗力与细菌相似。对环境渗透压敏感，渗透压的突变可致细胞破裂。对重金属盐、石炭酸、来苏尔和一些表面活性剂较细菌敏感，但对醋酸铊、结晶紫和亚锑酸盐的抵抗力比细菌大。对影响细胞壁合成的抗生素如青霉素不敏感。

二、 二、口腔支原体检验依据及原理

  支原体广泛存在于人和动物体内，是生物制品细胞培养生产工艺中常见的污染物，2020年版《中华人民共和国药典》要求使用精氨酸支原体培养基培养检测口腔支原体。具体操作要求为：将口腔支原体稀释至10^-3-10^-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内，每个稀释度接种3支试管，置36℃培养7-14天，观察培养基变色结果。口腔支原体可以利用培养基中的精氨酸，使培养基pH值升高，遇指示剂酚红使培养基变红。培养基中的猪胃消化粉、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳源、氮源、生长因子，氯化钠维持渗透压，酚红为酸碱指示剂。

三、培养基配方（g/L）：

四、口腔支原体固体平板法的具体操作步骤及培养结果

  1.液体培养基活化

  吸取保存的口腔支原体原液100uL，加入到精氨酸支原体肉汤培养基中，封口膜缠住管口，37度需氧培养3-4天，可发现培养管澄清且变红。说明有支原体生长且无杂菌污染。如下图所示：

口腔支原体液体培养结果

  2.固体培养基二次活化

  吸取经过初次活化的支原体培养液100uL,涂布于精氨酸支原体固体培养基平板上，封口膜包住平板边缘，37度培养6-10天，直到在光线下可以看到如下图所示的针尖大小的菌落。

口腔支原体固体培养结果

五、口腔支原体常规切片观察

  用消毒的小刀切割下一小块琼脂块，放于载玻片上，低倍镜下观察，可看到支原体呈现典型的"荷包蛋样"菌落，核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。

口腔支原体切片观察

口腔支原体镜检结果观察（低倍镜）	口腔支原体镜检结果观察（高倍镜）

六、口腔支原体染色步骤及镜检结果

  为了增加颜色的对比度，更好的观察检测支原体，可采用加染色液的方式对支原体进行染色。中国药典采用的为指示细胞培养法即DNA染色法，需要借助特殊的荧光染料和荧光显微镜进行观察。而一般的实验室并不具备这样的条件，因此可以使用一种更为简单的染色方法，借助两种常见的染液及普通电子显微镜即可观察。具体步骤为：将蕃红染液或结晶紫染液稀释10倍左右，直接加入到平板上染色10秒，之后用水冲洗掉，用小刀切割一块琼脂块上显微镜观察，可看到如下图所示，染色使支原体更加清晰，明显。下图分别为蕃红染色和结晶紫染色结果。

口腔支原体蕃红染色结果

口腔支原体结晶紫染色结果（低倍镜）

口腔支原体结晶紫染色结果（高倍镜）

七、整个操作过程中的注意事项

  1.染液必须要稀释，且染色时间不易过长，否则染色太深，观察效果不好。

  2.平板可以倒薄一些，这样切割下来的琼脂块会比较薄，便于光线的透过，观察起来也会更加清晰明亮。

  3.不建议用菌液直接滴加到载玻片上，因为菌液本身含菌量太少，实测含菌量一般低于10³/mL，因此难以快速发现支原体，且支原体为无色，与培养液混合后更难以在显微镜镜下找到。

  4.固体培养基加血清倒板后，一定注意整个平板要完全透明无气泡无杂质，如果平板状态不好，会对后期结果的观察造成干扰。

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