详解|| 中国药典和美国药典中支原体检测（培养法）检验流程及区别

一、《中国药典》2020年版 四部 3301支原体检查（培养法）

  主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体；必要时，亦可采用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

1.1培养基

  推荐使用的培养基：

  支原体液体培养基：支原体肉汤培养基，精氨酸支原体肉汤培养基；

  支原体半流体培养基：支原体半流体培养基，精氨酸支原体半流体培养基；

  支原体固体培养基。

  临用前加入灭能小牛血清(培养基：血清为8:2),并可酌情加入适量青霉素,充分摇匀。

  除上述推荐培养基外，亦可使用可支持支原体生长的其他培养基，但灵敏度必须符合要求。

  培养基灵敏度检查：采用变色单位试验法（CCU）；

  判定：以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。液体培养基的灵敏度，支原体肉汤接种肺炎支原体（ATCC 15531株）应达到10^-8，精氨酸支原体肉汤接种口腔支原体（ATCC 23714株）应达到10^-4。

肺炎支原体ATCC 15531在支原体肉汤及半流体中的生长状态

口腔支原体ATCC 23714在精氨酸支原体肉汤及半流体中的生长状态

1.2供试品检查流程

  供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查时可贮存于2~8℃；超过24小时应置于-20℃以下贮存。

  培养条件：36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。

  结果判定：培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格。如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格；如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。

二、美国药典USP40MYCOPLASMA TESTS（CULTURE METHOD培养法）

2.1培养基

  推荐使用的培养基：

  应使用足够数量的固体和液体培养基进行测试，以确保在供试品（试验物品/材料）中可能存在的少量支原体（约100cfu或100ccu）能够被检出。也可以使用其他培养基，但需符合标准要求。每批培养基都应进行适当的微生物检测（营养特性）。

  每次检测应包含至少2株已知的支原体菌种或菌株[见表1]，一株葡萄糖发酵型-肺炎支原体Mp或其等效种株；一株精氨酸水解型-口腔支原体Mo。只有在检测昆虫细胞系时，才应包括螺原体（例如，S.citri ATCC 29747，S.melliferum ATCC 29416，或等效的菌种和菌株），其在营养需求方面可能更挑剔一些，且需要较低的孵化温度（昆虫细胞系也是如此）。

表1 测试菌种

  营养特性（培养基的微生物检测）：向100mL液体培养基和至少9mL固体培养基中接入不超过100cfu每种支原体，培养。按规定的时间间隔，吸取0.2 mL液体培养物到固体培养基进行继代培养。使用显微镜观察。

  培养条件：

  液体培养基36±1℃，密闭容器，20-21天；

  固体培养基36±1℃，5~10% CO₂，足够湿润，不少于14天。

  判定：若固体培养基中支原体的菌落计数在0.5-log范围内，则固体培养基符合要求（0.5-log：即接种数为100cfu，待测培养基中生长菌落数应在32-316cfu范围内）。若液体培养基中每种测试菌的至少1次继代培养物能够在固体培养基中生长，则液体培养基符合要求。

  平板中的支原体菌落直径0.01-0.5mm，呈圆形，中心致密，低倍显微镜观察呈“煎蛋状”，显微图片如下：

  抑制物质（方法适用性）：对供试品（试验物品/材料）进行一次抑制物质检测，当生产方法发生变化可能影响支原体检测时，应重复进行抑制物质检测。通过加入和不加入供试品，进行培养基的营养特性测试，以证明不含抑制物质。如果试验微生物在没有供试品的情况下比有的情况下更早发生一次以上的继代培养，则说明存在抑制物质。同样，如果直接用供试品接种的平板，其菌落数量不在没有供试品接种的平板菌落数量的0.5-log单位范围内，也说明存在抑制物质。在这两种情况下，抑制物质必须通过适当的方法来中和或抵消它们的作用，例如通过使用不含抑制剂的底物或稀释在更大体积的培养基中。如果使用稀释，可以使用更大体积的培养基或可以分成几个100ml三角瓶。中和或其他过程的有效性是通过重新进行抑制物质检测来确认的。

2.2支原体检测

  供试品检测流程如下：

  注：*特定时间点指接种后第2~4天、第6~8天、第13~15天，第19~21天。每2~3天观察一次液体培养物，如果发生颜色变化，需进行继代培养。

  如果在加入供试品（试验物品/材料）时发生显著的pH值变化，可通过添加无菌氢氧化钠或盐酸溶液恢复到原来的pH值。

培养条件：36±1℃，5-10% CO₂，足够湿润环境。

  阳性对照：在固体培养基或液体培养基上，接种不超过100 cfu的至少一种测试菌。如果供试品的支原体检测定期进行，建议定期轮换使用测试菌[见表1]。 

  阴性对照：未接种的100mL每种液体培养基和琼脂平板作为阴性对照。

  结果判定：在规定的培养周期结束时，检查所有接种的固体培养基是否存在支原体菌落，如果没有发现典型支原体菌落的生长，供试品符合要求。如果在任何固体培养基上出现典型支原体菌落生长，则供试品不符合要求。如果观察到可疑菌落，使用合适的验证方法确定是否由支原体引起。

  如果液体培养基显示细菌或真菌污染，试验无效。如果每个培养基和每个接种日至少有1个平板出现支原体菌落，则试验是有效的。如果1个或1个以上阳性对照株在至少1个继代平板上未显示支原体生长，试验无效。如果一个或更多的阴性对照显示支原体生长，试验无效。

三、培养基检验过程中注意事项

  1) 抑制剂可使用青霉素20-80万IU/L；

  2) 制备平板（平皿直径Ф60mm，不少于9mL培养基）时，应谨慎操作，防止气泡形成；

  3) 菌液制备：使用相应的支原体液体完全培养基作为稀释液，依次进行10倍梯度稀释；

四、小结：ChP2020和USP40中支原体检测法的区别

  1）推荐培养基、血清不同；

  2）培养基验收的检测方法、判定不同；

  3）供试品的检测方法不同；

参考文献

  [1]《中国药典》2020版四部通则 3301 支原体检查法

  [2] USP40MYCOPLASMA TESTS

支原体检测用产品列表

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