聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂

录入时间:2021-10-13 16:10:30 来源：现代微生物培养基和试剂手册

【原理】

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺与N , N-次甲基双丙烯酰胺(bis)在催化剂四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵作用下聚合而成,通过两者浓度的改变可形成不同孔径的筛孔,聚丙烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重作用,能精细分离蛋白及核酸。十二烷基硫酸钠(SDS)是阴离子去污剂,它与蛋白质的疏水区相结合,可使蛋白呈一致的强负电荷,所以可增加聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨力。

【成分】

(1) A液:30%丙烯酰胺

丙烯酰胺	30g
N, N-次甲基双丙烯酰胺	0.8g
加水至	100ml
4℃避光保存

(2)B液:1.5mol Tris · HCl ,pH8.8。

(3)C液:10%SDS。

(4)D液:0.5mol Tris · HCl ,pH6.8。

(5)四甲基乙二胺(TEMED):原液。

(6)10%过硫酸胺:4℃保存,二星期内使用。

(7)电泳液:

Tris	6g
甘氨酸	28.8g
10%SDS	10ml
加双蒸馏水至	1000ml
调至pH8.8

(8)染色液:

0.2%考马斯蓝	若干ml
50%甲醇	若干ml
7%乙酸	若干ml

(9)脱色液:

50%甲醇	若干ml
7%乙酸	若干ml

(10)样本缓冲液:

0.05mol Tris. HCl ,pH6.8	若干ml
0. 1%SDS	若干ml
10%甘油	若干ml
0.1%二巯基乙醇	若干ml
0.002%溴酚蓝	若干ml

【制法】

1. 分离胶的配制:见表44—1。

2. 4%的样品胶的配制(100ml):

A液	13.3ml
B液	12.5ml
C液	1.0ml
双蒸馏水	72.2ml
TEMED	50μl
10%过硫酸铵	1.0μl

表44—1聚丙烯酰胺凝胶(分离胶)的配制

凝胶浓度	2.5	5	7.5	10	13	15	20(100ml)
A液(ml)	8.3	16.7	25.0	33.3	43.3	50.0	66.7
B液(ml)	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5
C液(ml)	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
双蒸馏水(ml)	78.0	69.6	61.3	53.0	43.0	36.3	19.6
TEMED (μl)	50.0	50.0	50.0	50.0	50.0	50.0	50.0
10%过硫酸铵(ml)	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2

【用途】

聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质或核酸的纯度、含量和分子量大小的鉴定和分析,也可用于蛋白质、核酸的纯化。其浓度与有效分辨率之间的关系见表44—2。

表44—2丙烯酰胺浓度及其有效分辨范围

丙烯酰胺浓度(%)	有效分辨范围
丙烯酰胺浓度(%)	核甘酸数	蛋白分子量(道尔顿)
3.5	100~1000
5.0	80~500	2.5~20.0X10⁴
8.0	60~400
10.0		1.5~7.0X10⁴
12.0	40~200
15.0		1.2~4.5X10⁴
20.0	10~100

【注意事项】

1. 电泳过程中,电压过高,会使凝胶发热。一般以较低电压,较长时间的效果为好。

2. 丙烯酰胺是神经毒物质,可经呼吸道或皮肤进入人体。实验操作时要戴手套,避免用口吸取溶液。

3. 凝胶板在电泳槽中固定后,用丁形玻璃管赶走底部气泡,至为重要。若有气泡,则凝胶中的蛋白或核酸带易产生弯曲。

4. 在进行蛋白凝胶电泳时,必须用已知分子量大小的蛋白作为分子量标记,同时进行电泳。常用的分子量标记为:

卵白蛋白	43000道尔顿
α-糜蛋白酶原	25700道尔顿
β-乳球蛋白	18400道尔顿
溶菌酶	14300道尔顿
细胞色素C	12300道尔顿
牛胰蛋白酶抑制物	6200道尔顿
胰岛素(A和B链)	～3000道尔顿

(第二军医大学刘沪丽供稿全章由第二军医大学谢正旸审编)

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