大肠埃希氏菌计数方法

一、大肠埃希氏菌简介

  大肠埃希氏菌（Escherichia coli）又称大肠杆菌，广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验结果为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。

二、参考标准

  《GB 4789.38-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数》。

三、检验流程

  （一）MPN法

图1 大肠埃希氏菌MPN计数法检验程序

  1.初发酵试验

  每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36±1℃培养24±2h，观察小倒管内是否有气泡产生，24±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养48±2h。产气者进行复发酵试验。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。

  根据标准菌株对月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤进行验证。大肠菌群、大肠杆菌和发酵乳糖的革兰氏阴性细菌产生气体，在小倒管内有气泡；其它细菌无气泡。结果如图2所示：

a:鼠伤寒沙门氏菌 b:大肠埃希氏菌 c:弗氏柠檬酸杆菌 d:阴沟肠杆菌 e:粪肠球菌 f:空白对照

图2 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤微生物质控结果

  2.复发酵试验

  用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放入带盖的44.5±0.2℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24±2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未有产气则继续培养至48±2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。

  根据标准菌株对EC肉汤进行验证。粪大肠菌群和大肠杆菌产生气体，在倒立小发酵管中有气泡。结果如图3所示：

a:大肠埃希氏菌菌 b:鼠伤寒沙门氏菌 c:弗氏柠檬酸杆菌 d:阴沟肠杆菌 e:肺炎克雷伯氏菌 f:空白对照

图3 EC肉汤微生物质控结果

  3.伊红美蓝（EMB）平板分离培养

  轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36±1℃培养18～24h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。           

  根据标准菌株对EMB培养基进行验证。典型大肠埃希氏菌菌落特征为具黑色中心有金属光泽，产气肠杆菌为粉红色菌落无光泽，鼠伤寒沙门氏菌为无色菌落。结果如图4所示：

a:大肠埃希氏菌 b:产气肠杆菌 c:鼠伤寒沙门氏菌

图4 EMB培养基微生物质控结果

  4.革兰氏染色

  挑取营养琼脂培养基上的纯培养的单个可疑菌落，进行革兰氏染色。大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，呈红色杆状。结果如图5所示：

图5 大肠埃希氏菌的革兰氏染色结果

  5.生化鉴定

  取培养物进行靛基质试验、甲基红试验、VP试验和柠檬酸盐利用试验，可选取使用大肠杆菌生化鉴定条进行生化鉴定，大肠埃希氏菌的生化反应结果为靛基质阳性、甲基红阳性、VP阴性、柠檬酸盐阴性。如图6所示：

图6 大肠埃希氏菌生化鉴定条试验结果

  6.结果判定

  大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为＋＋--或-＋--。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。

  （二）平板计数法

图7 大肠埃希氏菌平板计数法检验程序

  1.平板计数

  取2～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿， 每皿1mL。同时取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。

  将10～15 mL 冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3～4 mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36±1℃培养18～24 h。

  根据标准菌株对VRBA培养基进行验证，大肠埃希氏菌为紫红色菌落，有胆盐沉淀环；在紫外灯照射下有荧光。结果如图8所示：

a;大肠埃希氏菌 b;弗氏柠檬酸杆菌 c;阴沟肠杆菌

图8 VRBA培养基微生物质控结果

  注意事项：选择菌落数在10～100CFU之间的平板，暗室中360～366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。

  2.结果判定

  两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g(mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

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