干粉培养基煮沸灭菌的操作方法及注意事项

一、灭菌方法简介

  培养基在使用之前必须进行灭菌处理，将其所含活菌全部杀死或全部除去。常用的灭菌方法有过滤除菌、干热灭菌、湿热灭菌及辐照灭菌等。其中，湿热灭菌法又包括四种方式：煮沸法、流动蒸汽灭菌法、间歇灭菌法和压力蒸汽灭菌法。通常来说，使用比较多的是压力蒸汽灭菌法。

  但是对于有些培养基来说，高压条件会损坏培养基中的某些成分，不利于培养基的使用，所以只能采用煮沸灭菌的处理方法。本文主要就煮沸灭菌方法进行讨论。

二、煮沸灭菌的常见表述

  有关煮沸灭菌的描述，通常有如下几种方式：

  a、称取本品41.5g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，煮沸不要超过2分钟。无需高压灭菌。临用时制备，不得超过3小时。（参考VRBA培养基：点击查看）

  b、称取本品50.3g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至45-50℃，摇匀，倾入无菌平皿备用。无需高压灭菌。（参考BS培养基：点击查看）

  c、称取本品89g，煮沸溶解于1000ml蒸馏水中，冷至45-50℃时，倾入无菌平皿，备用。注：无需高压灭菌。（参考TCBS培养基：点击查看）

  d、称取本品57g，加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中，不要过分加热，冷至50-55℃时，倾入无菌平皿,部分开盖干燥2h，然后盖上，备用。无需高压灭菌。在 24小时内使用。（参考XLD培养基：点击查看）

  这些方法描述中，都特别强调“无需高压灭菌”、“不要过分加热”、“煮沸充分溶解”，那么究竟该怎样操作，才能达到既灭菌完全又尽量降低对培养基的破坏呢？

三、煮沸灭菌的实际操作

  1、关于煮沸方式，有人提出可以隔水煮沸，但经过反复试验，发现这种煮沸方式存在两大弊端：①温度不够，达不到灭菌效果；②经隔水煮沸的含琼脂培养基，在水浴的过程中易出现分层现象。

  2、为了对培养基进行有效煮沸灭菌，根据我们实践摸索，建议如下操作：

  ①准备好电磁炉和搪瓷缸（不要用铁质容器）；

  ②将培养基按比例加水，称量至搪瓷缸中，用玻璃棒不断搅拌，直至完全溶解、无明显团状物或颗粒；

  ③将搪瓷缸置于电磁炉上，大火烧开，期间持续搅拌，避免糊底；当液面完全沸腾后，立即将搪瓷缸从电磁炉上拿开，算是一次煮沸操作；液面回落后，立即放回电磁炉，重复上面的步骤；总共煮沸3次即可。

  ④将煮好的培养基冷却至需要的温度，进行倾注平皿等操作。

四、注意事项

  1、补水

  加热煮沸的过程，培养基中的部分水分会蒸发掉，造成水分偏少，影响培养基的质量（如平板强度等），导致菌落形态等结果的偏差，因此为了尽量减少误差，需要在煮沸之前，向搪瓷缸中补加适量培养基配制用水，经验估计，通常每煮一缸培养基需补加15-20ml水，实际操作中，需根据各实验室的具体情况（容器大小及装量）进行摸索。

  2、溶解

  所有的培养基，在煮之前必须搅拌至完全溶解，不允许将尚有成团培养基的状态下，直接进行加热煮沸，那样很容易出现灭菌不彻底的现象，尤其是有些含琼脂的培养基，甚至会有部分琼脂不能彻底溶解，导致倒出的平皿上有明显的麸皮状琼脂小颗粒，或者有些含有染料的培养基也可能出现染料颗粒，都会影响培养基的使用（所述各种情况见下图）。

  正确操作：

  错误操作：

  平板上出现未完全融化的琼脂颗粒：

  3、搅拌

  煮沸全程必须持续不断搅拌，以免糊底。

  4、防烫

  液面沸腾后，要及时将搪瓷缸从电磁炉上取下，以免液体沸出，造成培养基沾染或烫伤操作人员。

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