植物乳杆菌检验标准操作程序

标准依据：《GB/T 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测》

1 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

1.1 恒温厌氧培养箱：37±1℃。

1.2 冰箱：2-5℃。

1.3 天平：感量为0.1g。

1.4 均质器及无菌均质袋、均质杯。

1.5 振荡器。

1.6 无菌吸管：1 mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

1.7 无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。

1.8 无菌培养皿：直径90mm。

1.9 显微镜：10倍～100倍 。

1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2 培养基和试剂

2.1 MRS( Man Rogosa Sharpe) 琼脂培养基。

2.2 MRS肉汤培养基。

2.3 无菌生理盐水。

2.4 革兰氏染色液。

2.5 细菌生化鉴定试剂盒。

3 检验程序

植物乳杆菌检验程序见图1。

图1 植物乳杆菌检验程序

4 操作步骤

4.1 样品制备

4.1.1 固体和半固体样品

称取25g样品，置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min制成1：10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min-lO000r/min均质1min～2min制成1：10的样品匀液。

4.1.2 液体样品

应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1：10的样品匀液。

4.2 样品稀释

4.2.1 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装于9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

4.2.2 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

4.3 培养

根据对待检样品菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取样品匀液0.1mL接种于MRS琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃厌氧培养箱中培养48h±2h。

4.4 菌落计数

4.4.1 选取特征菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。 每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

4.4.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀。即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

4.4.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

4.5 鉴定

4.5.1 菌落挑选和纯培养

挑选平板上5个边缘透明、整齐的菌落分别转入MRS肉汤培养基37±1℃厌氧培养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。

4.5.2 形态学鉴定

革兰氏染色、镜检。植物乳杆菌为革兰氏阳性杆菌，呈直杆状，长度3.0μm～8.0μm，单个、成对或成链状，通常缺少鞭毛，无芽孢。

4.5.3 生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附B.1。乳杆菌属常见菌种主要鉴别特征参见表C.1。

5 结果计算

5.1 每个平板中植物乳杆菌的数量

每个平板中植物乳杆菌菌落数的计算见式(1) :

  a=b/A×C               ...............（1）

  式中：

  a—每块平板上的植物乳杆菌菌落数；

  b—挑取后经证实为植物乳杆菌的菌落数；

  A—挑取平板上用于验证的菌落数；

  C—平板上的所有特征菌落数。

5.2 菌落总数的计算方法

5.2.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中植物乳杆菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。

5.2.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(2)计算：

  N=∑C/（n₁+0.1n₂）×d       ...............（2）

  式中：

  N—样品中菌落数；

  C—平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

  n_1—第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

  n₂—第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

  d—稀释因子（第一稀释度）。

6 报告

6.1 结果判定

若样品菌落符合植物乳杆菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为植物乳杆菌。

6.2 结果报告

6.2.1 定性报告

在25g(mL)样品中检出或未检出植物乳杆菌。

6.2.2 定量报告

菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后面用0代替位数； 也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。

  本文节选自《GB/T 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测》。

附：

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GB/T 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测标准用到的培养基  点击下载

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