粪大肠菌群计数标准解析

一、参考标准

  根据《GB4789.39-2013 粪大肠菌群标准计数》中定义，粪大肠菌群是一群在44.5℃中培养24—48小时能发酵乳糖产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。

二、检验流程

  1、样本稀释

  固体和半固体样品：称取25g样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，制成1:10的样品匀液。

  液体样品：以无菌吸管吸取样品25mL置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。

  注意事项：样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节；根据对样品污染状况的估计，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。

  2、初发酵试验

  每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL，36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h。

  根据标准菌株对月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤培养基进行验证，结果如图一：

a:大肠埃希氏菌ATCC25922，b:阴沟肠杆菌ATCC23355，c:弗氏柠檬酸盐杆菌ATCC43864

d:粪肠球菌ATCC29212，e:空白对照

图一 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤微生物质控结果

  注意事项：液体样品可以选择原液；若是接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤。

  3、复发酵试验

  用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于预先升温至44.5℃的EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管放入44.5℃±0.2℃培养箱内，培养24h±2h，记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群阳性，不产气为粪大肠菌群阴性。

  根据标准菌株对EC肉汤培养基进行验证，结果如图二：

a:大肠埃希氏菌ATCC25922，b:产气肠杆菌ATCC35029，c:大肠埃希氏菌CMCC44102

d:弗氏柠檬酸杆菌ATCC43864 e：粪肠球菌ATCC29212，f:金黄色葡萄球菌ATCC25923 g：空白对照

图二 EC肉汤微生物质控结果

  注意事项：定期以已知为44.5℃产气阳性的大肠埃希氏菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

三、结果判定

  根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表，报告每g (mL)粪大肠菌群的MPN值。

  在10^-1～10^-5五个连续稀释度中确定最适的三个连续稀释度方法如下：

  a）有一个以上的稀释度3管均为阳性。选择三管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的两个更高稀释度（见表B.1示例a、b，表中带下划线的数字对应的接种样品量为最终选取的最适稀释度，下同）；

  b）在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时，则顺次下移到下一个更高三个连续稀释度（见表B.1示例c）；

  如果中间有某个稀释度没有阳性结果，但更高稀释度有阳性结果，则将此阳性结果加到前一稀释度，进而确定三个连续稀释度（见表B.1示例d）；

  如果不能按照这个原则找到三个合适的稀释度，则选择前一个较低的稀释度（见表B.1示例e）；

  c）没有任何一个稀释度3管均为阳性。如果没有一个稀释度的3管均为阳性，则选择三个最低稀释度（见表B.1示例f）；

  如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果，将此阳性结果加到选择的最高稀释度，进而确定三个连续稀释度（见表B.1示例g）。

  每g(mL)检样中粪大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表C.1

  举例说明：若粪大肠菌群的阳性管数的示例为3-3-2-0-1，则选择的稀释度为3-2-1，根据MPN检索表所得MPN数值为1500。

  注意事项：MPN检索表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]、每个稀释度接种3管。并且表内所列检样量如改用lg（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。

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