无菌检查方法适用性试验

   方法适用性试验。为保证无菌检验结果的准确可靠，当建立产品的无菌检查法时，应进行方法适用性试验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的生产工艺，原、辅料组分或检验条件发生改变时，应重新进行方法适用性试验。

   方法适用性试验时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作试验。供试品对每一试验菌应逐一进行方法确认。FTM培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；TSB培养基用于真菌和需氧菌的培养。在进行阳性试验时金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌应加入到FTM培养基中培养，而枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉应加入到TSB培养基中培养。

   薄膜过滤法的适用性试验。将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加人小于100cfu的试验菌，过滤，滤净后每个培养器内灌注100ml培养基；因方法适用性试验旨在确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，可向最终培养体系中直接加人小于100cfu的试验菌。方法适用性试验应在生物安全二级实验室内进行，不得在洁净实验区内操作菌液，操作全程需要注意保持环境的无菌性。取装有同体积培养基的容器加人等量的试验菌，作为阳性对照。含培养基的各试验容器按规定温度培养不得超过5天。各试验菌同法逐一进行验证，以大肠埃希菌代替培养基灵敏度实验中的铜绿假单胞菌，其余同培养基灵敏度试验。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。药品生产单位也可增加从生产环境及产品中发现的常见污染菌作为试验用菌，其意义是更能确定所选方法适合该产品中污染菌的检出。

   供试液和冲洗液经过薄膜过滤时流速不宜过快；每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量一般不超过500ml，最高不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。方法适用性实验的目的之一就是要寻找冲洗量相对较小的方法。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。常规选用滤膜直径约为50mm，若使用其他尺寸的滤膜，应对稀释液和冲洗液体积进行调整，并重新验证。

   直接接种方法适用性试验。取适宜装量的FTM培养基6管，分别加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌的菌液各2管；取适宜装量的TSB培养基6管，分别加入枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液各2管。每管加菌量小于100cfu。其中1管接人规定量的供试品，另1管作为阳性对照，各试验管按规定的温度培养不得超过5天。

   方法适用性试验的结果判断。与阳性对照比较,如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，并且与阳性对照容器内的对照菌培养结果相似，则供试品在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用消除，可按该法进行供试品的无菌检查法检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品在该检验条件下有抑菌作用，应重新进行方法适用性试验。

   具有抗菌活性的供试品，若采用薄膜过滤法，可根据供试品的抗菌活性强弱，采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法消除抑菌作用。若采用的是直接接种法，可根据实际情况增加培养基的用量、在稀释液或培养基中使用中和剂、灭活剂或表面活性剂等方法消除抑菌性。并重新进行方法适用性试验。若需使用中和剂、灭活剂或表面活性剂等，应证明其有效性，且对微生物无毒性。已进行过无菌检查方法适用性试验的供试品，按此法进行无菌检查。无菌检查时采用的方法应与方法适用性试验确认的方法相同。

   本文节选自《中国药品检验标准操作规范》（2019版）无菌检查法章节。

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