弯曲菌检验标准操作程序

1   方法来源

    GB 4789.9-2014《中华人民共和国国家标准食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》，定量检测方法和PCR鉴定方法来源于2013年卫生部食品安全优先评估项目《鸡肉中弯曲菌定量评估》和相关文献。

 

2   适用范围

    本程序规定了食品中弯曲菌[空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobactercoli)、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)、乌普萨拉弯曲菌(Campylobacterupsaliensis)和胎儿弯曲菌（Campylobacter fetus）]的检验方法。

    本程序适用于生禽肉和生畜肉中弯曲菌的检验。

3   设备和材料

    除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1  冰箱：2℃～8℃，-20 ℃，-80 ℃。

3.2  恒温振荡培养箱：42℃±1℃。25℃±1℃

3.3  水浴装置：36℃±1℃，100℃±1℃。

3.4  微需氧培养装置：能够提供微需氧条件（5%O2、10%CO2和85%N2），如三气培养箱、使用产气剂的厌氧罐/袋或其它可代用的装置等。

3.5  电子天平：感量0.01g。

3.6  无菌均质袋。

3.7  显微镜：10×～100×，有相差功能。

3.8  离心机：离心力≥ 20000×g。

3.9  全自动微生物鉴定系统。

3.10  漩涡混匀仪。

3.11  基因扩增仪。

3.12  电泳仪。

3.13  凝胶成像系统。

3.14  具塞试剂瓶（或三角瓶）：500mL，1000mL；玻璃试管：15mL；L玻璃棒。

3.15  无菌枪头：10μL,200μL, 1000μL。

3.16  无菌EP管：1.5mL；无菌冻存管：2mL。

3.17  孔径0.45μm～0.6μm，直径47mm左右的无菌滤膜。

4   培养基和试剂

4.1  Preston肉汤：见附录A中A.1。

4.2  缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A中A.2。

4.3  mCCD琼脂：见附录A中A.3。

4.4  Skirrow琼脂：见附录A中A.4。

4.5  Karmali琼脂：见附录A中A.5。

4.6  Preston琼脂：见附录A中A.6。

4.7  哥伦比亚琼脂：见附录A中A.7。

4.8  布氏肉汤：见附录A中A.8。

4.9  氧化酶试剂：见附录A中A.9。

4.10  马尿酸钠水解的检测试剂：见附录A中A.10。

4.11  吲哚乙酸酯纸片：见附录A中A.11。

4.12  弯曲菌保存培养基：见附录A中A.12。

4.13  弯曲菌运输半固体培养基：见附录A中A.13。

4.14  1mol/LNaOH溶液。

4.15  3%过氧化氢溶液。

4.16  生化鉴定试剂盒。

4.17  全自动微生物鉴定系统生化鉴定卡。

4.18  弯曲菌PCR检测试剂。

4.19  Tris-乙酸（TAE）、琼脂糖、LoadingBuffer、溴化乙锭（EB）。

4.20  超纯水。

4.21  无菌脱纤维羊血。

4.22  抗生素：头孢哌酮、多粘菌素B硫酸盐、利福平、两性霉素B、万古霉素、甲氧苄啶。

 

第一法 定性检验

5   检验程序

    检验程序见图1。

6   操作步骤

6.1   样品处理

禽胴体：无菌条件下，将禽胴体放入合适容积的无菌自封袋中，加入Preston肉汤淹没样品（按每1kg样品加入500mL Preston肉汤的比例），置于振荡器上，5采集的样品最好现场接种；如不能实现应将样品低温保存（4-7℃），但避免直接接触冰块。样品应尽快送达实验室检测，以避免弯曲菌的损伤/死亡。以100 r/min的速度震荡15 min，或反复揉搓禽胴体5 min（注意各个部位均要揉到）。无菌操作取出禽胴体，漂洗液进行检测。如果同时做多个检验项目，可以从禽胴体不同部位（脖子、胸、腿和肛门）处剪取检验需要量的肉和皮，均质2 min，取该混合样进行其他项目的检验，剩余的禽胴体依照上法用Preston肉汤漂洗后取漂洗液进行弯曲菌检验。

分割禽肉或畜肉：取分割肉1块（大于100g）放入无菌自封袋中，加入适量Preston肉汤淹没样品（按每1kg样品加入500 mLPreston肉汤的比例），以100r/min的速度震荡15min,无菌操作取出肉块，漂洗液进行检测。如果同时做多个检验项目，可以将多块分割肉块一起揉搓，剪取检验需要量进行其他项目的检验，剩余的分割肉（大于100g）依照上法用Preston肉汤漂洗后取漂洗液进行弯曲菌检验。

6.2  增菌

6.2.1 微需氧环境的建立：

抽气换气法（含有5%O2、10%CO2和85%N2的混合气体）：将无菌吸管一端连接混合气体钢瓶，另一端插入含有样品漂洗液的无菌自封袋中，密封袋口，打开混合气体钢瓶开关充气至无菌袋鼓起，轻轻晃动，使袋内的液体与混合气体充分接触，然后停止充气，双手按压排出袋内混合气体。以此法充气排气3次后再充入混合气体，拔出吸管，立即密封袋口。

微需氧产气袋法：将漂洗液倒入无菌瓶子内（将瓶子的盖子旋松或以无菌牛皮纸包扎瓶口，以利于气体的交换），将瓶子放入适当容积的微需氧培养装置（厌氧盒里放置微需氧产气袋，注意微需氧产气袋产生气体的量一定和厌氧盒子的容积相当）。

三气培养箱等仪器法：按仪器说明书调节温度和气体含量，待稳定后，放入含有漂洗液的瓶子（将瓶子的盖子旋松或以无菌牛皮纸包扎瓶口，以利于气体的交换）。

6.2.2 在微需氧条件下，42℃±1℃震荡（25～100r/min）或静止培养24h±2h。

6.3  分离培养

6.3.1 增菌液接种

将Karmali或mCCD琼脂平板和Preston或Skirrow琼脂平板在42℃±1℃烘干表面水分，将0.45μm~0.6μm无菌滤膜轻轻贴在平板的中间，不要产生空隙；取24h增菌液200μL~250μL滴加在滤膜上，室温静置45min~60min，待液体全部透过滤膜后，用无菌镊子将滤膜轻轻揭下，弃去，翻转平板，微需氧条件下42℃±1℃培养48 h±2 h。

6.3.2 可疑菌落的筛选

弯曲菌属在Karmali选择性平板上典型菌落形态一般有两种，一种呈浅灰或灰白色、半透明而中心颜色较暗，圆形，光滑，中间凸起、针尖状或小水珠状， 直径1mm～3mm，边缘整齐、有光泽的单个菌落；另一种呈浅灰白色、半透明、扁平或稍突起、水滴状，形状常呈不规则圆盘状，直径2 mm～5mm的单个菌落。禽漂洗液中以第一种菌落形态较为常见。

mCCD琼脂平板上的可疑菌落通常有光泽、潮湿、扁平，呈扩散生长的倾向，直径约为1mm～2 mm。

Skirrow琼脂平板上的第一型可疑菌落为灰色、扁平、湿润有光泽，呈沿接种线向外扩散的倾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落，直径约为1 mm～2 mm，边缘整齐、发亮。禽漂洗液中以第一种菌落形态较为常见。

Preston琼脂平板上的典型菌落形态一般也有两种，一种呈浅灰白色或略显浅粉白色，半透明、扁平或稍突起、湿润、水滴状，直径2 mm～9mm不等的单个菌落；另一种呈浅灰色、半透明、圆形、光滑、隆起，针尖状或小水珠状，直径1 mm～3mm，边缘整齐、有光泽的单个菌落。两种菌落形态均常见。

经过滤膜过滤培养后，一般平板上菌落都是纯的弯曲菌菌落。

6.4  鉴定

6.4.1 弯曲菌属的鉴定

挑取可疑菌落2～3个接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下42℃培养24 h±2 h，按照6.4.1.1~6.4.1.5进行鉴定，结果符合表1的可疑菌落确定为弯曲菌属。

表1 弯曲菌属的鉴定

项目	弯曲菌属特性
形态观察	革兰氏阴性，菌体弯曲如小逗点状，两菌体的末 端相接时呈S形、螺旋状或海鸥展翅状a
动力观察	呈现螺旋状运动b
氧化酶试验	阳性
微需氧条件下25 ℃±1 ℃生长试验	不生长
有氧条件下42 ℃±1 ℃生长试验	不生长
a有些菌株的形态不典型。 b有些菌株的运动不明显。

6.4.1.1 形态观察

对可疑菌落进行革兰氏染色，复染时使用0.5%的苯酚品红溶液。弯曲菌为革兰氏阴性，菌体弯曲如小逗点状，两菌体的末端相接时呈S形、螺旋状或海鸥展翅状。

6.4.1.2 动力观察

挑取可疑菌落用1mL布氏肉汤悬浮，用相差显微镜观察运动状态。弯曲菌属呈现螺旋状运动。

6.4.1.3 氧化酶试验

使用无菌棉签蘸取可疑菌落，将氧化酶试剂直接滴加到沾有菌的棉签上，如果在10 s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。弯曲菌属为阳性。

6.4.1.4 微需氧条件下25℃±1℃生长试验

挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，微需氧条件下25℃±1℃培养44 h±4 h，观察细菌生长情况。弯曲菌属不生长。

6.4.1.5 有氧条件下42℃±1℃生长试验

挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，有氧条件下42 ℃±1℃培养44 h±4 h，观察细菌生长情况。弯曲菌属不生长。

6.4.2  空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌的鉴定

6.4.2.1 过氧化氢酶试验

挑取菌落，加到干净玻片上的3％过氧化氢溶液中，如果在30 s内出现气泡则判定结果为阳性。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和海鸥弯曲菌为阳性。

6.4.2.2 马尿酸盐水解试验

挑取菌落（菌量要大），加到盛有0.4 mL 1％马尿酸钠的试管中制成菌悬液。

混合均匀后在36℃±1℃水浴中温育2 h或36℃±1℃培养箱中温育4 h。加入

0.2 mL茚三酮溶液，在36℃±1℃的水浴或培养箱中再温育10 min后判读结果。若出现深紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。

6.4.2.3 吲哚乙酸酯水解试验6

挑取菌落（菌量要大）至羟基吲哚醋酸盐纸片上，再滴加一滴灭菌蒸馏水。如果吲哚乙酸脂水解，则在5 min～10 min内出现深蓝色；若无颜色变化则表示没有发生水解。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌的鉴定结果见表2。

表2 空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌的鉴定

6.4.2.4 替代实验

对于确定为弯曲菌属的菌落，可以使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统来替代6.4.2.1～6.4.2.3的鉴定。

6.4.3  弯曲菌的PCR鉴定（可选项目）

按下列方法进行PCR鉴定。也可以使用商品化的试剂盒对可疑弯曲菌纯培养物进行鉴定，试剂盒使用前需经过验证合格，具体操作见产品说明书。

6.4.3.1 模板DNA的制备

无菌接种环挑取少量菌苔，在200μL无菌超纯水中混匀（菌悬液呈肉眼可见的微混浊状即可，不宜过度混浊），于100℃水浴中加热10 min后，13000×g离心2min，上清液即为制备好的DNA模板，将其转于另一无菌离心管中备用。

6.4.3.2 引物序列和目的基因片段见表3。

表3 五种弯曲菌特征基因序列和PCR片段大小

检测基因	引物序列	片段大小/bp
23S rRNA (弯曲菌)	23S-F: 5’-TATACCGGTAAGGAGTGCTGGAG-3’ 23S-R: 5’-ATCAATTAACCTTCGAGCACCG-3’	650
hipO (空肠弯曲菌)	CJ-F: 5’-ACTTCTTTATTGCTTGCTGC-3’ CJ-R: 5’-GCCACAACAAGTAAAGAAGC-3’	323
glyA (结肠弯曲菌)	CC-F: 5’-GTAAAACCAAAGCTTATCGTG-3’ CC-R: 5’-TCCAGCAATGTGTGCAATG-3’	126
glyA (海鸥弯曲菌)	CL-F: 5’-TAGAGAGATAGCAAAAGAGA-3’ CL-R: 5’-TACACATAATAATCCCACCC-3’	251
glyA (乌普萨拉弯曲菌)	CU-F: 5’-AATTGAAACTCTTGCTATCC-3’ CU-R: 5’-TCATACATTTTACCCGAGCT-3’	204
sapA12 (胎儿弯曲菌)	CF-F: 5’-GCAAATATAAATGTAAGCGG-3’ CF-R: 5’-TGCAGCGGCCCCACCT-3’	435

6.4.3.3 反应体系见表4。

表4 PCR反应体系组成

6.4.3.4 PCR反应条件

95℃预变性6 min后，按照95℃30s，59℃30s，72℃30 s进行30个

循环，然后72℃延伸7 min。产物当时不能检测时4℃保存。

6.4.3.5 PCR检测

分别取10 μL PCR产物，与2 μL 6×loading buffer混匀后，加样于点样孔中。5 v/cm，电泳30 min～40 min。与对照相比，若出现目的条带则为阳性。

7   结果报告

综合以上试验结果，报告样品中检出空肠弯曲菌或/和结肠弯曲菌或/和海鸥弯曲菌或/和乌普萨拉弯曲菌或/和胎儿弯曲菌。

如果没有可疑菌落、或可疑菌落鉴定后不是空肠弯曲菌或/和结肠弯曲菌或/和海鸥弯曲菌或/和乌普萨拉弯曲菌者或/和胎儿弯曲菌，报告样品中未检出空肠弯曲菌或/和结肠弯曲菌或/和海鸥弯曲菌或/和乌普萨拉弯曲菌或/和胎儿弯曲菌。

 

第二法 平板计数法

8   检验程序

弯曲菌平板计数程序见图2：

9  操作步骤样品处理

9.1.1 禽胴体：无菌条件下，将禽胴体放入合适容积的无菌自封袋中，加入缓冲蛋白胨水（以每1kg样品加入500mL缓冲蛋白胨水的比例），置于振荡器上，以100r/min的速度震荡15min，或反复揉搓禽胴体5 min（注意各个部位均要揉到）。无菌操作取出禽胴体，漂洗液作为原液进行检测。如果同时做多个检验项目，可以从禽胴体不同部位（脖子、胸、腿和肛门）处剪取检验需要量的肉和皮，均质2 min，取该混合样进行其他项目的检验，剩余的禽胴体依照上法用缓冲蛋白胨水漂洗后取漂洗液作为原液进行弯曲菌检测。

9.1.2 分割的肉块：取分割肉适量放入无菌自封袋中，加入缓冲蛋白胨水（以每1kg样品加入500 mL缓冲蛋白胨水的比例），以100 r/min的速度震荡15 min,无菌操作取出肉块，漂洗液作为原液进行检测。如果同时做多个检验项目，可以将多块分割肉块一起揉搓，从不同肉块上剪取检验需要量进行其他项目的检测，剩余的分割肉依照上法用缓冲蛋白胨水漂洗后，取漂洗液作为原液进行弯曲菌检测。

9.1.3 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取9.1.1或9.1.2漂洗液，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液（生理盐水或pH7.2磷酸盐缓冲液）的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

9.1.4 按9.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头。

9.2  样品的接种和培养

根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（一般选择原液、10倍、100倍或1000倍稀释液），每个稀释度各100μL，立即涂布于Karmali选择性琼脂平板上，每个稀释度每种平板做2个平行，于42℃±1℃微需氧环境（5%O2、10%CO2、85%N2）培养48 h±2 h。

9.3  可疑弯曲菌菌落形态

弯曲菌属在Karmali选择性平板上典型菌落形态一般有两种，一种呈浅灰或灰白色、半透明而中心颜色较暗，圆形，光滑，中间凸起、针尖状或小水珠状，直径13mm；边缘整齐、有光泽的单个菌落；另一种呈浅灰白色、半透明、扁平或稍突起、水滴状，形状常呈不规则圆盘状，直径2 mm～5 mm的单个菌落。鸡漂洗液中以第一种菌落形态较为常见。

9.4  菌落计数

9.4.1 若Karmali平板上未出现符合上述特征的可疑菌落，则样品中弯曲菌为阴性。

9.4.2 培养后，观察平板上出现的所有可疑菌落数，菌落形态通常为单一类别，有时候可能出现多种菌落形态。选择平均可疑菌落数15-150CFU/板的稀释度进行计数。

9.4.3 如果所有稀释度的平板上的平均可疑菌落数均不在15-150CFU/板范围内，其中一部分小于15CFU或大于150CFU，则选择平均可疑菌落数最接近15或150的稀释度，且菌落分离度好的平板进行计数。

9.4.4 如果所有稀释度平板可疑菌落数均>150CFU/板，则选择稀释倍数最大、菌落分离度好的平板进行计数。

9.5  弯曲菌纯化

9.5.1 用接种针从平均可疑菌落数15-150CFU/板的同一稀释度的两块平板上共挑取至少5个可疑菌落（可疑菌落总数不足5个时，全部挑取），划线接种于哥伦比亚血琼脂平板上，于42℃±1℃微需氧环境中培养48h±2h。

9.5.2 如果最高稀释度平板上的可疑弯曲菌平均菌落数>50CFU/板，则从该稀释度中挑取用于鉴定的菌落数应为平均菌落数的10%（最多10个菌落）。

9.5.3 如果同一种类型的菌落鉴定结果不一致（如菌落表型特征一样但鉴定结果不同），再多挑几个该种类型的菌落（总数可达到10个）进行纯化。

9.6  可疑弯曲菌菌落的鉴定

使用生化鉴定或PCR方法对可疑弯曲菌菌落进行鉴定，具体操作见6.4鉴定。

9.7  菌落计数和结果计算

依据生化鉴定或PCR鉴定结果，计算每块选择性平板上弯曲菌的实际菌落数。

计算公式如下：

每块平板上弯曲菌实际菌落数=两块平板上可疑菌落数的平均数×（鉴定为弯曲菌的阳性菌落数/挑取的可疑菌落数）

例如：同一稀释度的两块Karmali平板上分别有100CFU和85CFU可疑菌落，挑取5个可疑菌落进行鉴定后，结果显示4个菌落为弯曲菌，则阳性率为80%，则该稀释度下弯曲菌的实际菌落数为：（100+85）/2′80%=74CFU。根据稀释度和接种量计算每克样品中的弯曲菌数量：如10-1稀释度平板上弯曲菌平均菌落数为74CFU，则弯曲菌数量（CFU/g）= 74′10′（1/0.1）′（500/1000）注：74：10-1稀释度平板上弯曲菌平均菌落数为74；10：稀释倍数（10-1稀释度）；0.1：每平板上涂布样液量0.1mL（100μL）； 500/1000：500mL缓冲蛋白胨水/样品重量1 kg。

10   报告

根据9.7计算结果，报告每g样品中某种弯曲菌或几种弯曲菌的数量（小于100CFU，按“四舍五入”原则修约后以整数报告；大于或等于100CFU，以10的指数形式来表示，保留2位有效数字），以CFU/g为单位报告；如果平板上均无可疑菌落，则以小于1乘以最低稀释倍数乘以5报告。

11   菌株的保存和运输

11.1  菌株保存

将经过鉴定的菌株纯化于哥伦比亚琼脂平板上，42 ℃±1 ℃微需氧环境中培养18 h～24 h后，无菌棉拭子将哥伦比亚琼脂平板上的所有菌苔全部擦拭后，均匀悬浮于盛有弯曲菌保存培养基的冻存管中于4℃冰箱放置30 min，然后贮于-80℃冻存。

11.2  菌株运输

运送前，将冻存管从-80℃冰箱中取出，用接种环挑取少许冻存液，划线接种于1块哥伦比亚琼脂平板上，42℃±1℃微需氧环境中培养48 h后，用无菌接种环将所有菌苔全部刮下，转种于含5%裂解羊血的弯曲菌运输半固体培养基中，拧紧管盖后，置于装有冰块的保温装置中，运输时间不宜超过48 h。

 

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